研究背景脓毒症是一个系统性的、机体对有害炎症的响应,严重脓毒症(急性器官功能障碍继发于确定或疑似感染)和脓毒性休克(严重脓毒症和液体复苏不可逆转低血压)。血小板减少症是脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克常见的并发症,和疾病的严重程度相关,并预示着非常严重的后果。脓毒症是ICU患者发生血小板减少的独立危险因素。低血小板计数是脓毒症患者疾病严重程度的一个重要标志,是决定脓毒症患者死亡率的重要因素之一。如何有效地改善、治疗和控制脓毒症血小板减少成为临床医师治疗脓毒症的关键问题之一。脓毒症血小板减少症的机制是复杂的,许多感染致病菌可导致脓毒症如细菌、病毒、真菌、立克次氏体等等。目前研究表明,持续性或慢性病毒和感染可导致慢性血小板减少,如慢性丙肝病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类微小病毒B19等,而临床常见大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等细菌感染也常常合并血小板减少症。细菌和病毒感染与脓毒症血小板减少症发病密切相关,但其发病机制尚未完全阐明,目前除积极控制感染、必要时输注血小板,尚无有效治疗脓毒症血小板减少的方法。唾液酸是广泛存在生物体中的一种天然糖酸复合物,是重要的生物信息传递分子。血小板膜糖蛋白的糖链末端均有唾液酸(SA)修士覆盖,维持血小板的稳定性。唾液酸酶,也称为神经氨酸苷酶,是自然界中唾液酸释放的外切糖苷酶能够促进唾液酸从唾液酸复合物和唾液酸糖苷复合物末端清除。唾液酸酶广泛存在于病毒、细菌和哺乳动物的细胞中。静止的血小板内部含有唾液酸酶活性内部池,在机体受到感染或者外源细菌释放新的唾液酸酶到血清均可导致血小板唾液酸酶活性激活和增强。外源性和内源性唾液酸酶可以水解血小板糖蛋白终端的唾液酸,导致血小板去唾液酸化,而去唾液酸化的血小板可以被肝脏所清除,这一过程在脓毒症中很可能通过加入唾液酸酶抑制剂而被阻止。奥斯他韦(达菲),广泛应用于临床的有效的抗流感药物。它是病毒唾液酸酶(也称为神经氨酸苷酶)抑制剂,有报道应用醋酸奥司他韦治疗患有慢性免疫血小板减少症(ITP)的病人。由此我们假设血小板去唾液酸化与脓毒症血小板减少的发病机制密切相关,唾液酸酶抑制剂奥司他韦应用很可能纠正严重脓毒症患者的血小板减少症。研究目的本研究旨在明确血小板去唾液酸化与脓毒症血小板减少发病的关系,从而诠释脓毒症血小板减少症的一种可能的发病机制,同时评价唾液酸酶抑制剂奥司他韦在严重脓毒症血小板减少症患者促进或改善血小板生长的重大作用,为脓毒症血小板减少症的治疗提供新的治疗目标和对策。研究方法1.研究对象的选择：采用前瞻性、随机、多中心、临床对照研究(RCT)方法,选择2014-05月到2016-2月入住山东齐鲁医院、烟台毓璜顶医院、烟台传染病医院和烟台山医院的来自ICU、呼吸科、血液科、传染病科的感染伴或者不伴有血小板减少的脓毒症患者,包括严重脓毒症和脓毒症休克患者。2.研究分组：研究Ⅰ选取健康成年人为阴性对照组；随机选取入住年龄在18到80岁的脓毒症患者,根据感染后伴或不伴血小板减少分为：(1)脓毒症血小板减少组；(2)脓毒症血小板正常组。研究Ⅱ选取严重脓毒症伴血小板减少(PLT≤50×109/L)患者,根据电脑随机序列号,随机分为；(1)奇数号：奥司他韦应用组；(2)偶数号：对照组。3.入选标准：脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克患者诊断标准：根据2012年国际严重脓毒症和脓毒症休克诊疗指南的诊断标准。简单说,脓毒症是由明确或疑似感染加上至少两个下列条件：体温高于38.3℃或低于36℃,心率超过90次/分,呼吸急促,精神状态改变,白细胞(WBC)计数大于12×109/L或小于4×109/L或升高的血浆原降钙素(PCT)的水平。严重脓毒症定义为脓毒症+器官功能障碍。脓毒性休克被定义为脓毒症十低血压(液体复苏难以纠正的低血压)或高乳酸血症。血小板减少症诊断标准：细菌、病毒、真菌等感染致病菌导致血小板减少,血小板计数小于100×109/L。4.排除标准：假性血小板减少(血标本凝固,或者EDTA依赖的血小板抗体是否存在)；年龄小于18岁或者大于85岁；入院小于24小时；心肺复苏术后患者；怀孕和哺乳期患者；恶性肿瘤或血液病患者；有骨髓、肝、肾、小肠移植史患者；6个月内接受或正在接受免疫抑制剂和激素治疗患者；终末期肝或肾功能衰竭者；测试前输注血小板患者；药物相关性血小板减少患者,如抗生素、肝素、低分子肝素、Ⅱb/Ⅲa受体阻滞剂、ADP—受体拮抗剂、急性酒精中毒等。5.研究终点：主要观察结果为血小板去唾液酸化水平、血小板整体反应率和全因28天死亡率。次要结果包括血小板恢复时间、血小板输注量。血小板整体反应率被定义为入组后血小板计数恢复至正常水平以上(100×109/L)的人数占入组总人数百分比。血小板恢复时间计算为患者入组到血小板计数>100×109/L的时间间隔。6.数据收集：入组患者记录以下数据：1)患者年龄、性别、疾病、既往病史、住院号、入住ICU原因。2)入住重症患者24h序贯器官衰竭评分(SOFA)和急性生理学与慢性健康状况评分系统(APACHE Ⅱ)及预后死亡率、住ICU时间、住院时间、ICU死亡率及全因28天死亡率。3)血小板去唾液酸化水平。4)入组时实验室数据包括血液和化学测试,凝血化验和动脉血气分析。5)明确感染致病菌的各种检验,如病毒相关抗体检测、G实验、GM实验,及各种临床标本的细菌培养,如痰、肺泡灌洗液、血、尿、引流液、分泌物等。6)干预治疗,如机械通气和持续肾脏替代治疗(CRRT)。7)各种并发症出现,如脓毒症休克、急性呼吸衰竭综合征、出血和血栓等事件。8)血小板输注数量。各种实验室数据采集限定在脓毒症发病的24小时内。7. 奥司他韦的应用：研究Ⅱ两组患者治疗上均根据2012拯救严重脓毒症和脓毒症休克的诊治原则,予以抗感染、液体复苏、血管活性药物等相关治疗。奥司他韦治疗组：应用足量抗生素基础上,入组24小时内开始给予奥司他韦75mg q12h口服5天；对照组：只应用足量抗生素,两组患者均每日检测血小板的计数,直到血小板升至100×109以上。不良反应记录：重点记录发热、皮疹、恶心、呕吐、肝功能不良反应及血栓形成等不良反应。8. 血小板制备：抽取受试者外周静脉血2m1放入真空抗凝(EDTA或者肝素抗凝)管中,离心得富含血小板血浆,取20-50ul加入流式管中离心,得血小板沉淀。同时检测血常规明确血小板计数。9.去唾液酸化检测：流式细胞术检测血小板表面去唾液酸化后暴露的β Gals的水平,即以PE-Cy5-CD41a单克隆抗体标记血小板,并同时标以FITC-RCA-I, FITC-ECL, FITC-sWGA,测定记录RCA-I、ECL、sWG A的荧光百分比用来反映血小板去唾液酸化水平。10.统计学分析：数据处理应用SPSS16.0软件完成。所有变量均进行正态性检验,正态分布变量以均数±标准差(x±SD)表示,非正态分布变量以中位数及四分位数间距表示,分类数据显示为计数(百分比)。组间正态分布变量组间比较采用单样本t检验或one-way ANOVA,非正态变量组间比较采用Kruskal-Wallis检验,组间频数比较采用x2检验。血小板计数与年龄、SOFA、 APACHE Ⅱ等各个临床变量的相关相关性采用Spearman秩相关分析,影响28天是否死亡的多因素相关分析采用Logistic回归模型。采用Kaplan-Meier生存分析对奥司他韦治疗组和对照组20天累计生存时间进行比较。多变量Cox比例风险回归模型分析两组奥司他韦治疗成功的影响因素,在我们的研究中,这些变量包括年龄,性别,APACHE Ⅱ,SOFA和血小板有效生长时间等等。对比数据的差异程度P<0.01提示差异十分显著,P<0.05提示统计学差异有显著性。研究结果1.整个研究中,276名患者被观察,261例符合入组标准。其中134个是脓毒症不伴有血小板减少症患者,127人为脓毒症伴血小板减少症患者。而127例脓毒症不伴有血小板减少症患者中,110名为严重脓毒症患者同时血小板计数小于50×109/L参与研究Ⅱ。随机化后仅52例患者使用抗生素治疗(对照组),而其他54患者使用抗生素治疗+奥司他韦(奥司他韦组)。28天随访完成率为96.4%。2.脓毒症血小板减少患者比没有血小板减少症的患者有较高的SOFA评分[10(5,12)和5(3.25,7),P<0.001). PCT水平[6.69(1.0,38.9)和1.0(0.32,5.36),P<0.001)和肌酐水平[88(63.3,225)μmol/L和225(56,119.0)μmol/L,P=0.036),但有较低的平均动脉压(79.6±14.7 vs86.8±15.5mmHg,P<0.001)。脓毒症血小板减少症患者比没有血小板减少症的有较高的肾脏替代(25.2%比14.2%,P=0.029)和脓毒性休克(18.9%比8.2%,P=0.017)发生率。28天死亡率高脓毒症血小板减少症患者和无血小板减少症的患者比(分别为36.2%和14.2%,P<0.001)。3.影响28天死亡率的危险因素分析结果表明血小板计数与28天死亡率呈负相关(OR=0.963,95% CI：0.930-0.997,P=0.033)4.研究表明,血流感染、大肠杆菌和新布尼亚病毒感染是脓毒症患者易发生血小板减少症的危险因素。相比之下,肺部感染和铜绿假单胞菌绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌引起的脓毒症,血小板减少症的发生率相对少。5.数据表明,脓毒症伴血小板减少症患者其血小板去唾液酸化水平较不伴有血小板减少症患者明显增高,正如检测凝集素对比ECL(5.70±4.37% vs2.33±1.90%:P<0.001),RCA-I(95.64±4.19% vs 90.14±8.88%; P<0.05)or sWGA(0.50±0.293% vs 0.15±0.95%;P<0.001)。6.奥司他韦治疗治疗后两组的反应和结果提示,随机化治疗后15天内血小板反应率在奥司他韦组是45对54例(83.3%)相比,对照组是34对52例对照组(65.4%,P=0.045)。血小板恢复时间对比奥司他韦组5(4,6)天,对照组7(5,10)天(P<0.01)。血小板输血量奥司他韦组(0.676±1.36单位)较对照组(1.35±1.98单位；P=0.044)明显减少。7.奥司他韦治疗后两组血小板计数随着时间变化对比。最初,血小板计数分别为奥司他韦组41.81±10.29×109/L和对照组46.69±9.13×109/L,两组之间无显著差异(P=0.560)。两组血小板计数随着时间不断增加,第四天奥司他韦组达到91.30±21.51×109/L、对照组达到58.17±32.99×109/L,P=0.031,有统计学差异。从第四天到九天,两组之间有显著差别,其中第7、8、9天差异十分显著,第十天血小板计数分别为奥司他韦组198.8±82.6×109/L,对照组147.7±81.78×109/L,P=0.684,自第十天后两组血小板计数统计学无差异。8.多变量Cox比例风险模型被用来评估各个变量与奥司他韦治疗的影响,其中SOFA、血小板生长有效时间、机械通气、CVVH的P值均<0.05,有统计学意义,提示以上因素均影响奥司他韦治疗的成功率。研究结论1.脓毒症血小板减少患者血小板表面去唾液酸化水平明显高于不伴有血小板减少患者,表明血小板去唾液酸化很可能参与了脓毒症血小板减少的发病机制。2.血小板减少与脓毒症严重程度有关,是决定脓毒症患者死亡的一个重要的风险因素。3.研究表明抗生素联合奥司他韦治疗严重脓毒症血小板减少症可明显增加血小板反应率、缩短血小板恢复时间同时降低血小板输注量。