第一部分 吸烟对口腔黏膜上皮细胞防御功能的影响[目的] 吸烟可削弱呼吸道和胃肠道黏膜的防御功能,导致致病微生物的感染。然而,有关吸烟影响口腔黏膜防御功能的研究较少。本研究旨在观察吸烟对口腔黏膜上皮细胞防御功能的影响。[方法]通过免疫组化染色结合图像分析比较吸烟者与非吸烟者的正常口腔黏膜、口腔白斑上皮组织中核苷酸结合寡聚化结构域1 (nucleotide-binding oligomerization domain 1, NODI)、人β防御素(human beta defensins, hBDs)和半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteases, Caspase)-12表达水平的差异。联合应用HE染色、真菌嗜银染色和抗白色念珠菌抗体免疫组化染色,检测正常口腔黏膜和口腔白斑组织的白色念珠菌,比较非吸烟组和吸烟组之间阳性率的差异。[结果] 吸烟组正常口腔黏膜和口腔白斑上皮组织中NOD1、hBD-1和hBD-3的表达水平均明显低于相应的非吸烟组,而吸烟组正常口腔黏膜和口腔白斑上皮组织中hBD-2和Caspase-12的表达水平均明显高于相应的非吸烟组。吸烟组正常口腔黏膜和口腔白斑白色念珠菌阳性率均明显高于相应的非吸烟组。[结论] 吸烟可降低口腔黏膜上皮细胞的防御功能,增加白色念珠菌的感染。第二部分Caspase-12在香烟烟雾提取物影响口腔黏膜上皮细胞防御功能中的作用[目的]Caspase-12是炎症相关性Caspase家族的重要成员,在固有免疫防御反应的调控中起关键作用,可削弱肠道黏膜防御功能。本研究旨在观察香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract; CSE)对口腔黏膜上皮细胞Caspase-12表达的影响,探究Caspase-12在CSE影响口腔黏膜上皮细胞防御功能中的作用。[方法] 采用CSE对永生化口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1进行处理,ELISA法检测hBD-1、hBD-2和hBD-3分泌水平的变化,并将培养上清孵育白色念珠菌,通过平板接种菌落计数评价CSE处理后培养上清抗白色念珠菌活性的改变。同时采用免疫印记法检测CSE对Caspase-12表达水平的影响。在此基础上,通过RNA干扰诱导Caspase-12表达沉默。在CSE处理细胞后,采用荧光定量PCR法检测hBD-1、 hBD-2和hBD-3的：uRNA表达水平；采用ELISA法检钡hBD-1、hBD-2和hBD-3的分泌水平；将培养上清孵育白色念珠菌,通过平板接种菌落计数评价培养上清抗白色念珠菌的活性,比较Caspase-12 siRNA组和对照siRNA组之间的差异。[结果] CSE明显降低了hBD-1和hBD-3的分泌水平,升高了hBD-2的分泌水平。CSE处理后细胞培养上清抗白色念珠菌活性明显降低。CSE明显增强了Caspase-12的蛋白表达。Caspase-12表达沉默明显逆转了CSE对hBD-1和hBD-3mRNA表达和分泌水平的抑制作用,明显增强了CSE对hBD-2 mRNA表达和分泌水平的诱导作用。Caspase-12表达沉默显著提高了CSE处理后细胞培养上清的抗白色念珠菌活性。[结论] CSE可增强口腔黏膜上皮细胞Caspase-12的表达,Caspase-12在CSE抑制口腔黏膜上皮细胞防御功能和增加白色念珠菌感染中发挥重要作用。第三部分Caspase-12在香烟烟雾提取物影响口腔黏膜上皮细胞NOD1表达水平中的调控作用[目的] NOD1是重要的胞内模式识别受体,在口腔黏膜防御功能和细胞稳态维持中起重要作用。以往研究表明,CSE通过调控NOD1通路影响其下游hBDs的表达和分泌。本研究旨在观察CSE对口腔黏膜上皮细胞NOD1表达的影响,探讨Caspase-12在CSE影响口腔黏膜上皮细胞NOD1表达水平中的调控作用。[方法] 免疫印记法检测CSE处理对NOD1表达水平的影响。观察Caspase-12表达沉默对NOD1表达水平的影响。采用免疫共沉淀和免疫荧光双染法研究Caspase-12与NOD1的相互作用关系。在CSE处理细胞后,采用免疫印记法检测NOD1的表达水平,比较Caspase-12 siRNA组和对照siRNA组之间的差异。[结果] CSE明显抑制了NOD1的蛋白表达。Caspase-12表达沉默明显上调了NOD1的蛋白表达水平。Caspase-12与NOD共定位表达,存在蛋白相互作用。Caspase-12表达沉默部分逆转了CSE对NOD1蛋白表达的抑制作用。[结论] CSE可抑制口腔黏膜上皮细胞NOD1的表达,Caspase-12对NOD1表达水平的调控可能与CSE对口腔黏膜上皮细胞防御功能的抑制作用有关。