丙酸睾丸酮对AR+/HER-2+乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响

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目的:乳腺癌是一种受激素调控且具有高度异质性的恶性肿瘤,目前根据雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)表达状态的不同,可以将乳腺癌分为激素受体阳性型、三阴性型及HER-2过表达型。其中HER-2过表达型乳腺癌恶性程度高、生存率低,预后相对较差。抗HER-2分子靶向治疗药物如曲妥株单抗(Trastuzumab)的问世,极大地改善了该型乳腺癌患者的预后。但由于其单药治疗反应率仅为11%~26%,联合化疗药物反应持续时间仅为5~9个月,加之耐药现象的出现,使得HER-2过表达型乳腺癌复发、转移率仍较高。近年来的研究发现,雄激素受体信号转导通路在乳腺癌发生发展及复发转移过程中同样发挥着非常重要的作用,雄激素受体(androgen receptor,AR)可以作为判断乳腺癌预后转归的预测因子,并有希望作为乳腺癌治疗的新靶点。本文主要研究雄激素丙酸睾丸酮对AR+/HER-2+乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长的影响,并探讨其可能的作用机制,以期为HER-2过表达型乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:首先细胞免疫组织化学染色检测乳腺癌细胞株MDA-MB-453的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、雄激素受体(AR)及人表皮生长因子受体2(HER-2)的表达状态,确定该细胞株分子生物学类型;丙酸睾丸酮作用24h、48h、72h后,采用MTT比色法在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值,从而计算出细胞增殖及抑制率,明确丙酸睾丸酮对细胞株MDA-MB-453生长的影响;采用流式细胞技术检测10-4mol/L药理浓度丙酸睾丸酮作用24h、48h及72h后,MDA-MB-453细胞株的细胞周期及凋亡率,同时检测细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin dependent kinases 4,CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶6(Cyclin dependent kinases 6,CDK6)及B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)蛋白表达变化情况。结果:1显微镜下观察ER、PR免疫组织化学染色的玻片中,MDA-MB-453细胞核中未见棕黄色颗粒;AR免疫组织化学染色的玻片中,有MDA-MB-453细胞核中可见棕黄色颗粒,此型细胞约占细胞总数的60%;HER-2免疫组织化学染色的玻片中,有MDA-MB-453细胞胞膜可见棕黄色染色,此型细胞约占细胞总数的80%。2 10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L丙酸睾丸酮对乳腺癌细胞株MDA-MB-453分别作用24h、48h、72h,仅于10-4mol/L丙酸睾丸酮药理浓度组观察到对MDA-MB-453细胞株生长增殖具有抑制作用,余药理浓度组均未观察到对MDA-MB-453细胞株生长增殖具有促进或抑制作用。3 10-4mol/L丙酸睾丸酮对AR+/HER-2+乳腺癌细胞株MDA-MB-453生长具有抑制作用。24h的抑制率是10.90±11.95%,与空白对照组相比P=0.000;48h的抑制率是45.18±3.1%,与空白对照组相比P=0.000;72h的抑制率是66.20±8.7%,与空白对照组相比P=0.000。实验组(10-4mol/L)24h、48h、72h三组间抑制率两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。4 10-4mol/L丙酸睾丸酮作用24h时,MDA-MB-453细胞中G1期比率下降,S期比率升高,G2期比率下降,与对照组相比,P均<0.05。作用48h及72h时,细胞中G1期比率均升高,S期比率均降低,G2期比率均升高,与对照组相比,P均<0.05。5 10-4mol/L丙酸睾丸酮作用于MDA-MB-453细胞24h、48h、72h时,凋亡率分别是3.06±0.16%、15.91±2.08%、26.69±0.87%,与同时间点对照组中的凋亡率相比均增高,均P<0.05。实验组(10-4mol/L)细胞凋亡率24h、48h、72h三组间凋亡率两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。6 10-4mol/L丙酸睾丸酮作用24h、48h、72h时,MDA-MB-453细胞中m TOR蛋白表达量与对照组相比均增加(P<0.05),但48h与72h时实验组中的m TOR蛋白表达量之间无统计学差异,P>0.05。10-4mol/L丙酸睾丸酮作用24h、48h时,MDA-MB-453细胞中PTEN蛋白表达量与对照组相比差异无统计学意义,P>0.05;作用72h后,实验组细胞中PTEN蛋白表达量与对照组相比增加(P<0.05),同时,实验组细胞中72h PTEN蛋白表达量与24h、48h比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。7 10-4mol/L丙酸睾丸酮作用24h、48h时,MDA-MB-453细胞中Cyclin D1、CDK4、CDK6、Bcl-2蛋白表达量与对照组相比均增加(P<0.05);而作用72h时,上述蛋白表达量与对照组相比均减少(P<0.05)。结论:1 MDA-MB-453为ER-/PR-/AR+/HER-2+的乳腺癌细胞株。2丙酸睾丸酮对MDA-MB-453乳腺癌细胞生长具有抑制作用,且可能具有量效关系;10-4mol/L浓度丙酸睾丸酮对MDA-MB-453乳腺癌细胞的生长具有抑制作用,且抑制作用具有时效关系。3 10-4mol/L浓度丙酸睾丸酮可促使MDA-MB-453细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路活化,进而引起PTEN蛋白的负性调控。4 10-4mol/L浓度丙酸睾丸酮在最初作用24h内可能促进MDA-MB-453细胞增殖,随着随用时间的延长,而后48h~72h观察到抑制细胞增殖,该作用不单与Cyclin D1、CDK4、CDK6蛋白有关。5 10-4mol/L浓度丙酸睾丸酮在最初作用24h内可能抑制MDA-MB-453细胞凋亡,随着随用时间的延长,而后48h~72h观察到促凋亡作用,该作用可能不仅与Bcl-2蛋白有关,可能激活其他信号转导通路来介导其总的生长抑制作用。
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