利用基因表达谱芯片筛选胃癌及转移相关差异表达基因的研究目的胃癌是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤，广泛侵袭和重要脏器转移是绝大多数胃癌患者的致死原因，如何解决胃癌及其转移早期诊断和防治的难题，已成为提高胃癌患者5年生存率所面对的最大挑战。近年来人们已经认识到肿瘤及其转移是多基因多步骤相互作用连续发展的过程，对肿瘤进行整体全面的包括发展动态的研究是最终解决肿瘤防治的根本途径。基因表达谱芯片为研究胃癌及转移相关基因表达提供了理想的技术支持，通过对来源不同个体、不同组织、不同刺激条件下的组织细胞内表达情况的对比分析，筛选出具有个体特异性、组织特异性、刺激特异性差异表达基因群，并对基因群的变化特征和规律进行描述。本研究应用含有14784条人类全长基因的cDNA表达谱芯片，以临床切除的胃癌和正常胃粘膜组织、胃原发癌和转移癌组织标本为研究对象，筛选胃癌、淋巴结转移和肝转移相关差异表达基因，进一步应用RT-PCR、免疫组化和Western印记分析验证部分差异表达基因在胃癌、淋巴结转移组织中的表达，从分子水平阐释胃癌及其转移的机制，对有效防治胃癌、提高胃癌患者长期生存率具有重要的指导意义。实验方法1、标本收集与临床病理资料选取大连医科大学附属第一医院普外科手术切除、病理检查证实的胃癌6例，其中4例伴有淋巴结转移，1例伴有肝转移，每例于标本离体后立即取胃原发癌组织、配对的正常胃粘膜及转移灶癌组织，入液氮冷冻保存备用。所选用病例术前均未行放疗和化疗，且经组织学检查证实。2、cDNA微阵列芯片制备芯片采用上海生物芯片有限公司提供的人14KcDNA表达谱芯片，为监控芯片杂交数据的可靠性，设定阳性对照为看家基因(10个)：阴性对照为细菌基因(6个)：空白对照为点样液。人14KcDNA表达谱芯片基因总数14784个，矩阵点数为18点×18点×48(亚矩阵)，点间距230μm。3、mRNA抽提按Trizol一步法分别抽提胃癌组织、正常胃粘膜和淋巴结转移、肝转移组织总RNA，采用QIAGEN Rneasy Kit进一步纯化总RNA，应用琼脂糖凝胶电泳判断28S和18S的亮度比例评价总RNA的质量，分离mRNA。4、标记与杂交参照Schena等的方法逆转录cDNA探针并标记mRNA，分别用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记不同组织的mRNA。将含混合探针的杂交液与芯片变性后，将杂交液滴于芯片点样区，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃中温水浴杂交16h。5、结果分析采用激光共聚焦荧光扫描仪扫描芯片，用QuantArray~R分析软件读取数据，得出Cy3和Cy5标记的强度值，计算Ratior值为Cy3/Cy5。结果分析：(1)总RNA提取结果良好；(2) Cy3和Cy5信号荧光强度必须有一个＞800；(3) Ratio(Cy3/Cy5)比值的自然对数绝对值＞2或＜0.5，判断为差异表达基因。6、RT-PCR实验验证部分表达差异基因取胃癌组织、淋巴结转移组织的RNA在常规条件下从引物开始反转录，PCR扩增，检测筛选出的差异表达基因在胃癌组织和淋巴结转移组织中的表达，对基因芯片结果进行验证。7、验证差异表达基因EphB4的蛋白水平采用免疫组化和Western印记方法对筛选出差异表达基因Ephb4在正常胃粘膜、不同分期的胃癌和淋巴结转移组织中蛋白表达进行分析，同时探讨EphB4表达与胃癌临床病理因素的关系。8、统计学分析采用SPSS10.0软件，计数资料采用X~2检验，四格表的确切概率法，P＜0.05有统计学意义。结果1、RNA质量控制分别提取胃癌组织和癌旁正常组织中总RNA的含量在50ug～100ug之间，琼脂糖凝胶电泳结果分析RNA，28SrRNA和18SrRNA条带清晰，5S条带模糊，说明RNA纯度和完整性较好。2、差异表达基因分析本研究测定了胃癌的全基因序列，筛选出胃癌及转移相关差异表达基因。与正常胃粘膜组织相比，6例胃癌组织中共检出40个差异表达基因，21条基因出现显著表达上调，19条基因出现显著表达下调。与胃癌组织相比，在4例淋巴结转移组织中共检出46个差异表达基因，18条基因出现显著表达上调，28条基因出现显著表达下调。在肝转移癌组织中共检出178个差异表达基因，114条基因出现显著表达上调，64条基因出现显著表达下调。3、验证部分差异表达基因为了验证cDNA芯片实验中差异表达基因，我们选择7个差异表达明显的基因在6例胃癌组织中进行RT-PCR验证，其中5个基因表达上调(S100A6，S100A11，ETV4，CDH17和Ephb4)、2个基因表达下调(NK4和PPP2R1B)。进一步选择2个差异表达明显的上调基因在4例胃癌淋巴结转移组织中进行RT-PCR验证，分别为S100A4和Ephb4，经RT-PCR验证其表达趋势与基因芯片检测结果一致。4、验证差异表达基因EphB4的蛋白水平免疫组化和Western btot结果显示，EphB4阳性表达位于肿瘤细胞的胞浆和血管内皮细胞中，为棕黄色颗粒，染色均一，40例胃癌组织中EphB4的阳性表达为23例(57.5％)，配对的正常胃粘膜组织中EphB4的阳性表达为6例(15％)，两组之间的差异具有显著性(P＜0.05)。EphB4表达水平与胃癌浸润程度、淋巴结转移和Lauren分型密切相关，与患者的性别、年龄和分化程度无关。结论1．经基因芯片检测分析，胃癌组织与正常胃黏膜相比基因表达存在明显差异，淋巴结转移癌灶、肝转移癌灶与胃原发癌相比基因表达也存在明显差异，提示胃癌的发生、发展和转移是多基因参与的过程、多基因变异的结果。2．部分差异表达基因经RT-PCR重复验证，S100A6，S100A11，ETV4，CDH17，NK4，PPP2R1B，S100A4和Ephb4基因异常表达可能参与胃癌发生发展。3．采用免疫组化和Western印记分析进一步验证差异表达基因EphB4在胃癌中表达，发现EphB4在胃癌组织中异常高表达，且与胃癌浸润程度、淋巴结转移和Lauren分型有相关性，提示EphB4基因有望成为胃癌治疗新靶点。