灰葡萄孢（Botrytis cinerea）已对多种类型杀菌剂普遍产生了抗药性，目前已有的分子检测方法只能针对每个突变位点进行分别检测或者针对同一靶基因不同变异碱基进行检测，面对大量田间抗药菌株，已有检测方法显然费时、费力且效率低下，所以迫切需要一种高通量分子检测方法的建立。近年来研究发现，氢分子对于许多疾病具有潜在治疗作用，对于植物也有广泛的生物学效应，参与植物多种胁迫应答。但面对如此广泛的生物学作用，氢分子作用机制的研究一直停留在选择性清除羟自由基这一假说层面，更缺乏氢分子其他作用机制的直接证据。质膜可能是氢分子与细胞作用的第一道屏障，但并未见有关二者相关性的报道。为了能够缓解化学防治方法带来的诸多问题，本研究从氢对灰葡萄孢致病及植物抗病性等方面的影响入手，拟探索一种不会对环境造成压力，又能影响植物抗病性的新思路，并对氢分子的作用机制进行初步研究，为解开氢分子广泛的生物学效应的分子机制奠定基础。　　综上所述，采用悬浮芯片技术，建立了一种同时分析灰葡萄孢中与多种类型杀菌剂相关的抗药位点的高通量检测方法;从微生物和植物两个方面入手，探讨了氢对其生长发育、致病性或抗病性等的影响;首次发现高等植物质膜上具有吸氢与放氢双向氢化酶活性，氢能够通过该活性影响质膜上的质子流动，参与氧化还原反应，主要结果如下:　　(1)研究的八种与灰葡萄孢菌抗药相关的基因型分别为:BenA-E198(GAG)、BenA-198A(GCG)、SdhB-H272(CAC)、SdhB-272Y(TAC)、BcOS1-I365(ATC)、BcOS1-365S(AGC)、erg27-F412(TTC)和erg27-412S(TCC)。采用基因克隆及重叠延伸PCR技术（引入定点突变），构建完成了8种野生型及包含突变位点在内的突变型质粒标准品。进一步采用基于等位基因特异性引物延伸技术(Allele-specific primer extension，ASPE)的悬浮芯片系统，经方法优化，最终完成了悬浮芯片检测方法的条件摸索。　　(2)已优化的悬浮芯片技术针对上述八种灰葡萄孢抗药相关基因型最低检测下限可低至1拷贝。在10ng基因组DNA背景下，针对突变型BenA-E198A(GCG)、SdhB-H272Y(TAC)、BcOS1-I365S(AGC)和erg27-F412S(TCC)的检测灵敏度分别为0.45‰、4.5‰、0.45‰和0.45‰，对于基因组DNA的最低检出量为0.1ng。试验重复性检测结果显示变异系数(CV)小于10％。对田间灰霉抗药菌株进行检测，与测序结果相比，该检测方法准确性达100％。本方法是同时检测BenA、SdhB、BcOS1和erg27四种抗药相关基因的首次研究，对于田间灰霉抗药菌株的大规模分子检测及早期预警具有重要意义。　　(3)氢能够降低拟南芥及辣椒幼苗抵抗灰霉病菌的侵染能力，加重其发病程度。但氢对灰葡萄孢孢子萌发、菌丝生长、致病性及抗药性等均无明显作用。进一步从植物角度分析其抗病性降低的原因，发现使用100％富氢水培养绿豆幼苗，下胚轴直径及鲜重并无明显变化，但能够显著促进绿豆幼苗下胚轴的伸长生长，并且随着氢浓度的升高，促进效果越明显，100％H2培养的绿豆黄化幼苗下胚轴皮层细胞显著长于对照。与无氢水培养的绿豆幼苗相比，氢对幼苗生长素(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)的含量影响不大，100％H2培养的幼苗在4h时脱落酸(ABA)含量稍低。氢适当降低了4h时胚根的超氧阴离子含量，降低了120h龄绿豆下胚轴中过氧化氢及超氧阴离子的含量，提高了超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化物酶(POD)的活性，表明氢能够激活植物的抗氧化酶系统，减少活性氧的积累。　　(4)进一步对氢的作用机制进行研究。采用H2依赖的苄基紫精(BV)的还原及还原性甲基紫精(MV)驱动的H2的再生试验，发现绿豆下胚轴及辣椒茎部质膜上同时存在着吸氢和放氢双向氢化酶活性。具有将H2氧化提供质子与电子或者催化质子还原成H2的能力。RT-qPCR试验结果显示，在绿豆种子萌发过程中，下胚轴、根、叶中均能检测到预测氢化酶基因的表达，且氢能够显著影响辣椒及绿豆的氢化酶基因的表达水平。以上结果表明氢代谢途径及氢发挥基因表达调控功能的效应在高等植物中可能是普遍存在的。进一步研究发现，氢能够显著影响绿豆幼苗下胚轴表面的质子流速，加速质膜中电子与质子的传递速率，显著促进NADH-铁氰化钾氧化还原酶及H2驱动的NADH的再生活性，并发现植物质膜上存在铁氰化钾(Fe3+)/亚铁氰化钾(Fe2+)和NADH/NAD+之间的双向氧化还原反应。综上所述，高等植物质膜中存在双向氢化酶活性，氢能影响质子流动，并直接参与调节质膜的氧化还原反应。这是长久以来关于氢分子与质膜氧化还原系统关系的首次研究，很可能成为氢分子作用机制的突破口，对于揭开氢分子的广大生物学效应具有重要意义。