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目的:重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)可引起一系列复杂的免疫反应,影响疾病的发展及其预后。在此过程中,血液系统凝血功能也随着胰腺炎症反应的发生而出现重大变化。fgl2(fibrinogen-like protein2/fibroleukin),即纤维蛋白原样2凝血酶原酶,是一种新近发现的凝血因子,能够通过不依赖于经典内外源凝血途径的独立途径直接产生纤维蛋白,从而在微血栓形成过程中具有重要作用。本研究通过观察在SAP大鼠胰腺及外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)中fgl2凝血酶原酶的表达,并与假手术组(shamoperation,SO)大鼠比较,探讨fgl2凝血酶原酶在SAP大鼠胰腺的作用及意义。
方法:
1.将48只体重约200-250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠随机平均分为SO组和SAP组,每组24只。采用经胰管注射4%牛磺胆酸钠法诱发大鼠SAP模型,SO组仅开腹后翻动肠管即关腹,术后每只大鼠均予2 mL/100g体重于背部皮下补充生理盐水。
2.造模成功后,各组于术后1h,4h和8h分批处死大鼠(各时点8只)。于大鼠下腔静脉抽取5 mL静脉血,其中4 mL以2500×g分离血清置于-20℃保存备用;余1 mL采用密度梯度离心法分离PBMC,置-80℃保存备用。留取新鲜胰腺组织,一部分固定于4%多聚甲醛液中,待行组织病理学检查;余胰腺置冻存管中于-80℃保存,待行real-time PCR检测。
3.全自动生化分析仪检测血清淀粉酶(amylase,AMY)含量。
4.常规苏木素-伊红染色观察大鼠胰腺病理变化,并行胰腺病理学评分;Masson染色观察大鼠胰腺微血栓形成,随机计数微血管中微血栓形成的阳性血管率。采用real-time PCR、免疫组织化学法、免疫印迹法测定fgl2凝血酶原酶在大鼠胰腺及PBMC中的表达。
5.采用SPSS15.0软件包进行统计学分析。所有数据以(x)±SD表示,进行正态性检验和方差齐性分析,采用单因素方差分析进行组间、组内差异性检验。两连续变量关联强度使用Pearson相关系数(r)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:成功诱发大鼠SAP模型。
1.血清淀粉酶:SAP组血清淀粉酶较SO组在各时点均显著升高(各时点P<0.01),模型诱发成功。SO组各时点间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.胰腺形态学观察:SO组各时点胰腺组织形态未见异常,胰腺小叶清晰;同SO组相比,SAP组胰腺组织均显示具有不同程度的病理损害。Masson染色阳性血管率在SAP组中的各时点显著高于正常组(P<0.01)且随时间延长具有增加的趋势(P<0.01)。
3.fgl2 mRNA及蛋白质的表达:SAP组大鼠胰腺及PBMC的fgl2 mRNA和胰腺fgl2蛋白质表达相比SO组均明显升高(P<0.05),且随病程延长逐渐增多(P<0.01)。免疫组化染色显示fgl2凝血酶原酶主要表达在SAP组大鼠胰腺微血管内皮细胞中。
4.fgl2凝血酶原酶表达与阳性血管率及胰腺病理评分相关性分析:Pearson相关分析显示胰腺fgl2凝血酶原酶表达与阳性血管率存在显著相关(r=0.842,P<0.01);胰腺(r=0.852,P<0.01)及PBMC(r=0.735,P<0.01)内fgl2表达与胰腺病理评分存在显著相关。
结论:fgl2凝血酶原酶可能通过介导胰腺内微血栓的形成引起胰腺损伤,且fgl2表达与胰腺损伤程度密切相关,因此可能用作早期预测SAP发生的标记物。