结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis. Mtb)引起的传染性疾病。据世界卫生组织报道,目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌。随着多重耐药菌、极度耐药株的出现,艾滋病与结核共感染人群的增加使得活动性结核病人日益增多。目前,卡介苗是唯一获得批准的被广泛使用的结核病预防疫苗,对于儿童卡介苗具有良好的保护效果,但对于成人其保护效果不容乐观,对于抑制潜伏期结核的复发更是毫无作用。因此研制新的结核病疫苗迫在眉睫,未来的结核病疫苗不仅要对刚出生婴儿以及未感染结核菌的人群提供良好的预防作用,对于已经感染结核菌但尚未发病的感染人群也要具有增强细胞免疫、加速清除结核菌的保护作用。本研究用分子生物学技术构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。应用此疫苗在小鼠体内进行了免疫原性评价,同时观察了此疫苗的预防保护效果和治疗效果。一、Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建及其表达用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,应用MegaTran 1.0瞬时转染293T细胞,用抗Ag85B的多克隆抗体、抗Esat6的单克隆抗体和抗HspX的单克隆抗体分别进行Western-Blot检测,均能检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。这种成功构建的能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒为后期进行的免疫原性评价和保护力评价奠定了基础。二、Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的免疫原性评价将上述融合基因DNA疫苗免疫小鼠对其免疫原性进行初步评价。BALB/c小鼠进行一侧股四头肌肌肉注射免疫,每次100μl/只,间隔2周免疫一次,共免疫3次,同时设BCG组、空质粒免疫组(pcDNA)和pHspX免疫组。在免疫的第2周,第4周及最后一次免疫后2周检测小鼠血清中的总IgG水平。末次免疫后2周,小鼠摘眼球取血,进行CD44, CD8+和γδT细胞比例测定；无菌取脾分离小鼠脾淋巴细胞,检测小鼠血清中针对HspX蛋白的特异性IgG2a和IgGl比值；体外用HspX抗原刺激小鼠脾淋巴细胞后,通过淋巴细胞增殖实验和ELISPOT实验检测小鼠脾淋巴细胞的增殖能力和脾淋巴细胞中能分泌抗原特异性IFN-γ的细胞数量；应用ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、IL-2和IL-4分泌水平。在体液免疫应答中,融合基因DNA疫苗诱导小鼠产生的血清总IgG OD值均高于其他三组(P<0.05),且抗体亚类以Thl型的IgG2a为主(P<0.05)。在细胞免疫应答中,融合基因DNA疫苗组小鼠的脾淋巴细胞特异性增殖明显,指数为2.33,显著高于BCG组的增殖指数1.26(P<0.05)。应用Ag85B.Esat6和HspX抗原体外刺激后,融合基因疫苗组脾淋巴细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数量均明显高于其他三组(P<0.01)。融合基因疫苗可使CD4+T细胞和CD8+T细胞明显增殖,所占比例分别为27.58%和8.64%,但与BCG免疫小鼠相比,差异无显著性(P>0.05)。外周血γδT细胞比例,四个组均无差异(P>0.05)。融合基因疫苗组的IFN-γ和IL-2的水平分别为1005.72±67.12 pg/ml和84.63±8.76pg/ml,明显高于其他三组(P<0.05),但四个组均未检出IL-4含量。三.Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的效力学评价DNA疫苗对MTB感染小鼠的预防保护效果：小鼠末次免疫完成后2周,用5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv通过尾静脉注射的方式感染,6周后无菌分离小鼠的脾和肺,计数脾肺组织的细菌荷菌量,以log10CFU表示。结果表明,空质粒对照组小鼠的脾肺荷菌量分别为5.48±0.11 log1o和5.40±0.09log10,融合基因疫苗组小鼠的脾肺荷菌量分别为4.97±0.05 log1o和4.65±0.22 log1o,二者比较有统计学差异(P<0.05),提示融合基因疫苗对MTB感染小鼠有明显的保护作用,但其保护作用与BCG相比差异无显著性(P>0.05),BCG免疫小鼠的脾肺荷菌量分别为4.88±0.13log10和4.46±0.17 log10。DNA疫苗对MTB感染小鼠的治疗效果：小鼠经5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv尾静脉感染4周后,再给小鼠肌肉注射重组质粒DNA(1μg/μl),每次100μl/只,间隔2周注射一次,共注射3次,同时设空质粒治疗组(pcDNA)和pHspX治疗组。本研究中的治疗效果实验并未设置BCG阳性对照组原因在于BCG对于结核菌感染后人群并无保护效果。末次注射后6周,无菌分离小鼠的脾肺,计数脾肺组织的细菌荷菌量,以log10CFU表示。结果表明,MTB感染小鼠经注射空质粒后,脾肺荷菌量分别为5.43±0.11 log10和5.46±0.08 log10;而注射融合基因质粒DNA组小鼠的脾肺荷菌量分别为4.88±0.18 log10和4.92±0.10 log110二者比较有统计学差异(P<0.05),提示融合基因疫苗对MTB感染小鼠有一定的治疗作用。四、结论本研究首次将结核分枝杆菌休眠期抗原HspX与生长早期抗原Ag85B和ESAT-6联合使用,成功构建了能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX。我们对这种新型DNA疫苗分别进行了免疫原性和效力学评价,发现此疫苗可在小鼠体内刺激产生较强的体液和细胞免疫应答,具有较强的免疫原性。通过先免疫后感染的方式,对此疫苗进行了预防保护效果评价,发现融合基因DNA疫苗可以显著减少小鼠体内脾肺荷菌量,但这种保护作用并不能超过BCG。同时,通过先感染后免疫的方式,对此疫苗进行了治疗效果的评价,发现此融合基因DNA疫苗也具有一定的治疗作用。所以,与传统的BCG相比,此新型DNA疫苗不仅强烈的诱导了Thl型细胞免疫反应,而且还具有一定治疗效果,这对于结核病的防治是十分有意义的。