异位妊娠和妊娠滋养细胞疾病是妇产科常见的疾病，早期诊断是提高疗效，改善预后的关键。因此，早期定性、定位诊断胚胎着床点或滋养细胞集群位置成为妇产科工作者不懈追求的目标。 自从1969年超声造影剂概念的提出以来，超声造影剂引起了超声工作者的注意，在医学超声诊断及研究领域得到了越来越多的应用。但是这些研究都基于造影剂能使超声显像回声增强基础之上，无组织或器官特异性及选择性。国内资料显示目前没有见到造影剂在异位妊娠和滋养细胞疾病等方面的研究报道。 随着对超声造影剂研究的不断深入，研究人员正在探索用特异性配体连接到微泡造影剂表面称之为靶向超声造影剂，这种靶向微泡对于病变靶组织病变有较好的亲和力，使之达到靶向组织或器官，选择性地与相应的配体结合，从而特异性的增强靶组织超声信号，实现早期探测细小病变甚至实现局部靶向治疗的目标。因此，本实验通过制备耦合抗HCG抗体的靶向微泡超声造影剂，在体外进行其对JAR细胞作用的研究，观察靶向超声造影剂对JAR细胞的结合能力，靶向结合的稳定性以及超声下靶向微泡的敏感性，为今后的胚胎着床点定位研究及滋养细胞的定位定量研究，达到早期排除异位妊娠及滋养细胞肿瘤的定位诊断，甚至为临床药物治疗乃至局部靶向化疗等提供科学依据。 材料与方法 1、细胞培养： 1.1JAR细胞的培养置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。每2天换液一次。当细胞生长至约占瓶底壁80％面积时进行传代培养。 1.2取子宫内膜组织后用消化培养法进行原代培养，分离得到的子宫内膜间质细胞，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。细胞生长至约占瓶底壁80％面积时，以0.25％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化传代培养。 1.3子宫内膜间质细胞的鉴定用免疫组织化学方法进行细胞鉴定。 2、靶向超声造影剂的制备参考文献方法进行。将抗人HCG抗体与Sonovue微泡悬液按等体积混合，在4℃条件下反应2h，PH值7.2～7.4之间，静置分层后，取上层混悬液进行鉴定。 3、靶向微泡造影剂的鉴定 3.1玻片凝集实验取洁净载玻片分别加上层混悬液及Sonovue各20μl，然后在载玻片上分别滴加等体积鼠抗兔IgG血清和等体积生理盐水。不时轻轻摇动，光镜下观察。 3.2免疫荧光实验取洁净载玻片分别加上层混悬液和Sonovue各20μl，分别加入FITC标记的羊抗兔IgG血清，避光反应15分钟，在荧光显微镜下观察。 3.3流式细胞仪检测取250ul上层混悬液和等体积FITC标记的羊抗兔IgG血清混合后，1000转×3min，PBS重悬后在流式细胞仪器上进行检测，用150μl上层混悬液和等体积PBS为对照组。 4、靶向微泡造影剂与JAR细胞的靶向结合实验 4.1花环形成实验将生长良好的JAR细胞制成细胞悬液(2×105/ml)，取100μl上述细胞悬液分别加入靶向微泡造影剂或Sonovue微泡，室温振荡10min，光镜下观察细胞和微泡的结合情况，以结合5个微泡以上的细胞为阳性，每张盖玻片上观察10个视野内花环形成率，以子宫内膜间质细胞为对照组。 4.2花环形成阻断实验取出已经贴壁生长的JAR细胞爬片，用PBS液冲洗，洗去贴壁不牢的细胞及细胞碎片组织，分别加入20μl不同浓度(相对浓度100％、50％、25％)的抗HCG抗体，室温下反应20min后，用PBS液洗去未结合的抗HCG抗体，再加入靶向微泡造影剂20μl，室温下反应10min，用PBS液洗涤后计算花环形成率。 4.3靶向微泡造影剂与JAR细胞结合力的观察取出已经长满细胞的载玻片共12张(其中6张为JAR细胞，6张为子宫内膜间质细胞)，PBS液冲洗之后，分别加入靶向微泡造影剂20μl，室温下反应10min，以0.6m/s的速度冲洗后，光镜下计算靶向造影剂微泡与细胞的结合率。 4.4流式细胞仪检测制备JAR细胞悬液，加入靶向造影剂微泡及FITC标记的羊抗兔IgG血清，1000转×3min，PBS重悬后在流式细胞仪器上进行检测，以等体积细胞悬液加等体积靶向微泡造影剂和PBS为对照组。 5、靶向微泡造影剂的超声下显影取500ml的生理盐水一袋，去除内部气体。将20μl的靶向造影剂注射到生理盐水中，高频探头(频率13MHz)表面涂抹耦合剂紧贴输液袋上进行超声扫描，空白输液袋作为对照组。 结果 1、靶向微泡造影剂制成后的鉴定为了对用交联法制备的靶向微泡造影剂进行鉴定，进行了玻片凝集实验、免疫荧光染色实验及流式细胞仪检测。当加入鼠抗兔IgG血清后，光镜下观察原来均匀分布的靶向微泡造影剂形成轻度的凝集状态，而加生理盐水后仍是均匀分散的微气泡。Sonovue微泡加入鼠抗兔IgG血清或生理盐水后均未见凝集反应。靶向微泡造影剂经FITC标记的羊抗兔IgG血清染色后，荧光显微镜下可见靶向微泡表面发出明亮的荧光，而单纯的Sonovue微泡则未见明显荧光。流式细胞检测显示Sonovue微泡与兔抗人HCG抗体的结合率为67.63％。均证明兔抗人HCG抗体已经结合到了Sonovue微泡上。 2、靶向微泡造影剂与JAR细胞的靶向结合 2.1靶向微泡造影剂与JAR细胞悬浮液混合反应后，显微镜下观察可见多个靶向微泡造影剂结合在JAR细胞周围，形成花环。JAR细胞与靶向微泡造影剂的花环形成率74.00±5.66％，子宫内膜间质细胞与靶向微泡造影剂的花环形成率为11.00±1.58％(两组之间差别有统计学意义P＜0.05)；JAR细胞与Sonovue的花环形成率为1.60±1.14％，子宫内膜间质细胞与Sonovue的花环形成率为1.40±1.16％(两组之间差别没有统计学意义P＞0.05)。 2.2当用25％、50％抗HCG抗体预处理JAR细胞之后，花环形成减少，花环形成率分别为64.40±3.21％和44.60±5.94％；当用100％抗HCG抗体预处理JAR细胞之后，花环形成率为9.20±1.30％。 2.3当靶向微泡造影剂与贴壁JAR细胞反应后，镜下观察JAR细胞与靶向微泡造影剂的结合率为85.80±3.35％。用0.6m/s的恒速PBS缓冲液冲洗后，结合率为82.40±3.97％。冲洗前后靶向微泡造影剂与JAR细胞的结合率差别没有统计学意义(P＞0.05)。对照组子宫内膜间质细胞与靶向微泡造影剂冲洗前后的结合率分别为5.00±3.53％和3.00±3.16％，差别也没有统计学意义(P＞0.05)。 2.4流式细胞检测结果显示：JAR细胞与靶向微泡造影剂的结合率为81.03％。 3、靶向微泡造影剂的超声下显影在实验组，在注入靶向微泡造影剂0时，靶向微泡造影剂在超声仪显示屏幕上显示成条带状光点回声反射。5～10分钟之后，靶向微泡造影剂均匀弥散，扫描时可见超声屏幕上出现密集的光点回声，每个反射回声直径1～3mm。从1小时开始每隔1小时抽出1ml计数，得出微泡浓度为分别为：192.67±6.36个/ml，185.00±2.88个/ml，180.00±5.77个/ml，173.33±14.53个/ml，差异没有统计学意义(P＞0.05)。这段时间内在超声仪显示屏幕上仍表现为密集的光点回声。从第4小时开始每10分钟计数一次直至超声仪屏幕上光点消失，得到的微泡浓度分别为103.00±8.81个/ml，36.00±2.31个/ml，4.00±2.08个/ml，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论 1、本研究中所制备的靶向微泡造影剂在体外可以与JAR细胞特异性结合，与对照组子宫内膜间质细胞之间存在显著性差异，且随着JAR细胞数目的不断减少，花环形成率也随之降低； 2、靶向微泡造影剂与JAR细胞特异性结合力在一定时间内具有一定的强度，可以抵抗毛细血管内血流的生理性冲洗的破坏； 3、在高频超声下(频率13MHZ)，靶向微泡造影剂在生理盐水中生成的微泡可呈现明亮密集的高回声光点，且可维持4～5个小时，足够临床超声造影所需； 4、用交联法成功制备了能与JAR细胞靶向结合的靶向微泡造影剂，此方法操作简便，反应时间短，不仅不会对微泡造成破坏，还保持了靶向微泡造影剂的免疫活性。