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海洋动物肠道内存在许多微生物,它们对宿主的生长发育、免疫调节、营养吸收都起着十分重要的作用,对这些海洋动物肠道菌群的研究,将助于了解海洋微生物的生理生化特征以及它们与宿主的关系,并对海洋微生物资源的挖掘、益生菌的开发和养殖病害的防治都有着十分重要的指导意义。
本文以凡纳滨对虾、仿刺参和皱纹盘鲍3种海水养殖经济动物作为研究对象,主要采用平板培养的方法和分子微生物生态学手段—PCR-DGGE和Illumina高通量测序技术对肠道微生物多样性进行分析,结果如下:
1.比较分析了健康幼虾DX-1、患病幼虾DX-2和健康成虾DX-4肠道菌群的差异,DGGE结果显示:健康幼虾肠道微生物主要以微小杆菌属(Exiguobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)以及巨型球菌属(Macrococcus)占优势,而患病幼虾肠道微生物主要以弧菌属(Vibrio)占优势,健康成虾肠道微生物以气单胞菌属(Aeromonas)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)以及鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis)占优势。利用Illumina高通量测序技术对这3个对虾肠道样品进行进一步分析,结果显示对虾肠道样品DX-1、DX-2、DX-4的OTU数分别为295、94、435。3个样品一共检测到9个门13个纲87个属的细菌以及一些未分类的细菌,其中健康幼虾肠道菌群主要分布在Bacilli和Gammaproteobacteria类群,其中以微小杆菌属(Exiguobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)以及巨型球菌属(Macrococcus)占优势;患病幼虾肠道菌群较为单一,主要分布在Gammaproteobacteria类群,其中以弧菌属(Vibrio)占绝对优势;健康成虾肠道菌群主要分布在Gammaproteobacteria和Erysipelotrichia类群,其中以气单胞菌属(Aeromonas)和未分类的细菌占优势。由此说明,对虾的健康状态以及不同生长阶段对对虾肠道菌群结构有较大的影响。
2.从仿刺参肠道内分离到29株单菌,其中以芽孢杆菌属(Bacillus)占优势,其次弧菌属(Vibrio)、微杆菌属(Microbacterium)、深海单胞菌属(Thalassomonas)、粪产碱菌属(Alcaligenes),其中大部分细菌都表现出较强的降解蛋白质和琼脂的能力。利用2种分子生物学手段对同一海域不同渔排上的仿刺参的肠道菌群结构进行研究,DGGE结果显示:不同渔排上的海参肠道菌群结构差异显著,其中来自渔排A的海参SC-A肠道微生物以副球菌属(Paracoccus)和亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)为优势,来自渔排B的海参SC-B肠道微生物以沃雷氏菌属(Olleya)和弓形杆菌属(Arcobacter)占优势。通过Illumina高通量测序技术对海参肠道菌群进行进一步分析,结果显示2个海参肠道样品的OTU数分别为1549和1797,表明海参肠道菌群非常丰富,经过序列比对分析,海参肠道细菌分布在15个门25个纲中,共检测到438个属以及许多未分类的细菌,其中渔排A中海参肠道细菌以副球菌属(Paracoccus)、动性球菌属(Planococcus)、亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)、Poseidonocella、无色杆菌属(Achromobacter)以及未分类的细菌占优势,次优势的菌属有弧菌属(Vibrio)、比齐奥氏菌(Bizionia)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢菌属(Bacillus)和Sinorhizobium;渔排B中海参肠道细菌以沃雷氏菌属(Olleya)、Endozoicomonas、Tropicibacter、弧菌属(Vibrio)、希瓦氏菌属(Shewanella)以及未分类的细菌占优势,次优势菌属有无色杆菌属(Achromobacter)、Marinitalea、弓形杆菌属(Arcobacter)、志贺氏菌(Shigella)、Rubritalea、假单胞菌属(Pseudomonas)。其中VibriD、Bacillus、Shewanella、Pseudoalteromonas等为水产养殖动物肠道常见菌,而Paracoccus、Planococcus、Olleya等优势菌在海参和其他水生动物肠道内报道较少,推测可能来自于海参的养殖环境。
3.从皱纹盘鲍肠道分离到45株单菌,主要分布在Bacilli和Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria类群,其中以葡萄球菌属(Staphylococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)为占优势,其次是假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、盐单胞菌属(Halomonas)和弧菌属(Vibrio)。底物水解实验表明分离到的菌水解底物的能力不强,其中水解蛋白的菌株最多,占到全部可培养菌的52%,而降解海藻酸钠、油脂的菌株最少,占到全部可培养菌的4%。利用PCR-DGGE和高通量测序技术2种分子微生物生态学方法研究皱纹盘鲍的肠道菌群结构以及饥饿处理下肠道菌群的动态变化,DGGE结果显示皱纹盘鲍的肠道菌群主要由柔膜菌纲(Mollicute)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)细菌构成,其中以类支原体属(Mycoplasma-like)、类中间原体属(Mesoplasma-like)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)为主,其中最主要的优势菌为Mycoplasma-like。利用Illumina高通量测序技术对饥饿处理4,9和13天的3个皱纹盘鲍肠道样品做进一步分析,结果表明这3个样品的OTU数分别为804、1840、756,鲍鱼肠道细菌的组成分布在20个门26个纲,其中以柔膜菌纲(Mollicute)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)占优势,分别占到全部菌群的63%和17%。3个样品共检测到385个属以及一些未分类的细菌,其中优势菌属为Mycoplasma-like、类Mesoplasma-like、Methylophaga和未分类的细菌等,次优势的菌属有Tamlana、Vibrio、Psychrilyobacter、Lacinutrix、Rubritalea、Pseudomonas、Shewanella、Formosa、Bizionia和Agarivorans等。结合这两种分子生态学方法,证明Mollicutes是皱纹盘鲍肠道菌群的主要优势类群。同时,饥饿对鲍鱼肠道微生物的组成和结构也有影响,随着饥饿处理时间的延长,鲍鱼肠道菌群呈现一定的变化规律,其中,Mycoplasma-like比例明显下降,Mesoplasma-like和Methylophaga比例则明显上升。