【摘 要】
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阿维拉霉素,由绿色产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）发酵生产的一款饲用抗生素,具备良好的促生长及代谢调节功能,已在畜禽养殖中广泛应用。当前,阿维拉霉素生产菌株的产素能力低、发酵工艺不成熟、生产成本高等难题制约了其在国内市场的产业化生产与应用。本研究对阿维拉霉素野生菌株进行多重诱变育种及理性筛选,并通过多种策略优化其发酵工艺,构建更为高效合理的发酵体系,以期为
【基金项目】
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中原千人计划·中原院士基金（192101510004）； 绿色制造2025（工信部节函[2018]272号-3）； 河南省重大公益专项“小麦绿色精深加工关键技术研究开发与示范”（201300110300）； 河南省创新示范专项“小麦副产品（谷朊粉）高值化开发与产业化示范”（201111110100
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阿维拉霉素,由绿色产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）发酵生产的一款饲用抗生素,具备良好的促生长及代谢调节功能,已在畜禽养殖中广泛应用。当前,阿维拉霉素生产菌株的产素能力低、发酵工艺不成熟、生产成本高等难题制约了其在国内市场的产业化生产与应用。本研究对阿维拉霉素野生菌株进行多重诱变育种及理性筛选,并通过多种策略优化其发酵工艺,构建更为高效合理的发酵体系,以期为阿维拉霉素的菌种选育及发酵生产提供一定的理论参考。主要研究内容如下:（1）对阿维拉霉素野生菌株Streptomyces viridochromogenes S219分别进行紫外（Ultraviolet,UV）、常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP）及UV+ARTP复合诱变,结合Ca Cl2理性筛选阿维拉霉素高产突变菌株。经参数优化得UV、ARTP、紫外与ARTP复合诱变的最佳诱变时间分别为180 s、70 s、70 s,对应的致死率分别为86.05%、94.17%、92.59%,正突变率分别为8.75%、10.00%、9.58%。以25 g/L的Ca Cl2为筛选压力,经多轮诱变筛选获3株阿维拉霉素产量提升较显著且遗传稳定性较好的突变菌株,分别命名为Z-6、A-9及F-23,其阿维拉霉素产量分别为29.31、36.84、45.73 mg/L,较野生菌株S219（18.56 mg/L）分别提高了57.92%、98.49%、146.39%。（2）对各高产突变菌株的菌丝发育形态学比较研究,并从阿维拉霉素产量、菌体干重及发酵过程中还原糖、总糖、氨基氮消耗等多种参数来分析比较各突变菌株的发酵性能。形态学观察显示突变菌株Z-6、A-9及F-23的菌落变小、产色素能力减弱、孢子呈藕节状椭圆形、生长速度加快、抑菌作用增强。突变菌株Z-6、A-9及F-23的最大菌体干重分别为14.21、15.48、18.99 mg/m L,分别比野生菌株提高了10.24%、20.09%、47.32%（野生菌株12.89 mg/m L）。突变菌株Z-6、A-9及F-23对总糖的利用率较野生菌株分别提高了2.14%、10.11%、15.82%;对还原糖利用率分别提高了为9.16%、15.14%、16.28%;对氮源利用率分别提高了9.55%、14.08%、18.02%。且各突变菌株的阿维拉霉素合成时期较野生菌株分别延长了36 h、48 h和48 h。突变菌株Z-6、A-9及F-23的细胞生长、底物消耗、前体供应及抗生素合成能力均强于野生菌株,表明紫外与ARTP诱变技术结合Ca Cl2理性筛选是选育阿维拉霉素高产突变株的有效手段。（3）经单因素及正交试验优化种子培养基及发酵培养基,获最佳培养基配方后,进一步优化发酵参数,确定最优的发酵基础工艺。优化后种子培养基最佳配方为（w/v）:葡萄糖2%,蛋白胨2%,Ca2+0.05%,Mg2+0.05%,氯化钠0.2%,K2HPO40.01%,经种子培养基优化将阿维拉霉素产量提升至46.14 mg/L。发酵培养基最优组合为（w/v）:可溶性淀粉1.5%、糊精0.5%、葡萄糖1%、玉米浆0.2%、黄豆粉0.6%、豆粕粉0.4%、蛋白胨0.6%、Ca Cl20.2%、Mg SO4·7H2O 0.1%、K2HPO40.1%、Fe SO4·7H2O 0.01%、KNO30.1%。突变菌株F-23发酵最佳条件为:发酵培养基初始p H 7.4,接种量6%（v/v）,种龄30 h,发酵时间216 h,发酵温度28℃,转速200 r/min,装液量35 m L/250 m L。最终将阿维拉霉素产量提升至53.25 mg/L,较优化前提升了16.44%。研究结果表明优化发酵培养基初始p H、种子质量、接种条件、摇床发酵条件等基础参数,是提高突变菌株F-23产阿维拉霉素的有效措施。（4）通过在发酵体系中添加不同类型的氧载体,改善其发酵溶氧水平。结果显示,在发酵24 h时添加1.3%（v/v）的正十二烷作为氧载体,阿维拉霉素的发酵效果最佳。相比于对照组,发酵24 h时,加入正十二烷（1%,v/v）使菌株的菌体干重增加了7.24%,阿维霉素的产量增加了13.03%（52.58 mg/L）。而加入吐温20或正己烷后,菌株的菌体干重较对照组分别下降了11.53%、17.60%,阿维拉霉素产量较对照组分别降低了20.41%、31.66%,表明吐温20与正已烷可能对阿维拉霉素的合成起着明显的抑制作用。而正癸烷、正十六烷对菌株的生长发育及抗生素合成无明显影响。（5）通过补加L-缬氨酸、D-木糖、乙酸钠等前体,并优化葡萄糖补料流加方式,提高阿维拉霉素的生物合成,从而确立最优的发酵补料策略。优化后发酵补料最佳策略为:30 h时补加1.25%乙酸钠,36 h时补加0.25%L-缬氨酸和1.00%D-木糖,同时采用恒速间歇流加0.15%葡萄糖策略补糖。最终将突变株F-23的阿维拉霉素产量提高至64.88 mg/L,较补料优化前整体提升21.84%。
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