第一部分ROCK在糖皮质激素促进黑色素瘤迁移、侵袭中的作用研究背景和目的:随着我国工业化和现代化发展,生活节奏加快,竞争日益激烈导致工作和生活压力的增大,使处于慢性应激状态的人群越来越多。一些基础研究和临床资料显示,持久的慢性应激,尤其是心理上的应激与当前我国肿瘤的发生率越来越高,年龄呈现低龄化等特点密切相关。慢性应激与肿瘤发生发展的关系近年来正成为人们关注的热点问题之一。作为最重要的应激激素,糖皮质激素(glucocorticoid,GC)具有强大的免疫抑制、抗炎和维持内环境稳定的作用,并参与胚胎发育、创伤修复等过程。此外,人工合成的糖皮质激素,如地塞米松(dexamethasone,Dex)在临床治疗中亦被广泛应用——不仅是多种自身免疫性疾病和器官移植术后的长期用药,也是多种实体肿瘤化疗期间的辅助用药,能预防肿瘤患者化疗的不良反应。不仅急慢性应激时可导致体内GC的增高,长期应用糖皮质激素类药物也可导致GC的医源性增高,因此GC与实体肿瘤发生发展的关系受到密切关注。因此,阐明糖皮质激素(GC)如何影响实体肿瘤的进展具有重要意义。肿瘤侵袭转移是肿瘤患者最终死亡的主要原因,包括肿瘤细胞局部浸润并从原发部位脱落,进入血循环或者淋巴循环中,在远处转移灶处定植且继续生长等多个步骤和过程。这其中细胞迁移运动和侵袭能力在肿瘤细胞转移中起到决定性作用。目前为止,糖皮质激素对肿瘤迁移、侵袭和转移的作用的相关研究十分有限,仅有的研究结果表明糖皮质激素对不同肿瘤的侵袭转移作用并不一致。不一致的研究结果是否与不同类型的肿瘤细胞相关,即GC对肿瘤细胞迁移、转移的作用是否具有细胞特异性并不清楚,因此有必要采用不同的肿瘤细胞进一步研究GC对肿瘤转移的作用及其机制。黑色素瘤是死亡率最高的皮肤恶性肿瘤,在全球范围内发病率逐年上升。其特点是恶性程度高,进展快,最容易发生远处转移。虽然有临床资料表明,糖皮质激素受体(GR)的表达丰度与黑色素瘤病理学Clark分级成正相关性,提示我们GC与黑色素瘤的发生发展有关。但是,GC如何影响黑色素瘤细胞本身,特别是如何影响黑色素瘤侵袭转移还不清楚且其机制不明。因此本文首次从体外和体内研究了GC对黑色素瘤细胞迁移、侵袭和转移的影响,在此基础上探讨了GC促进黑色素瘤细胞迁移/转移的机制,重点研究了ROCK信号通路在GC促进黑色素瘤细胞迁移/转移中的作用。研究方法:细胞实验中,我们用100n M Dex(人工合成的GC)处理黑色素瘤细胞(B16F10和A375)相应的时间进行后续实验。Western blot检测蛋白表达;q RT-PCR检测m RNA的表达;利用Boyden transwell小室,细胞划痕实验和预包被基质胶的侵袭小室分别检测黑色素瘤细胞迁移和侵袭的能力;细胞粘附实验检测黑色素瘤细胞与细胞外基质的粘附能力;MTT实验检测黑色素瘤细胞的增殖情况;Rho-GTP pull down实验检测Rho A,Rho B,Rho C的活性;ELISA实验检测黑色素瘤细胞分泌的Fibronectin水平;动物实验中,我们利用C57BL/6小鼠和裸鼠制作黑色素瘤细胞尾静脉转移瘤模型,给予50 mg/L皮质酮(小鼠体内的糖皮质激素)饮水12天后观察黑色素瘤细胞肺转移情况;HE染色用来确定肺部黑色转移灶的病理学性质;放射免疫试剂盒检测血浆皮质酮水平。研究结果:1.应激剂量的Dex(100 n M)不影响黑色素瘤细胞(B16F10和A375)的增殖,能够促进黑色素瘤细胞的粘附,迁移和侵袭。在C57BL/6小鼠和裸鼠黑色素瘤细胞尾静脉转移瘤模型中,给予含有50mg/L皮质酮的饮水12天后可以导致体内皮质酮水平的升高并在体内促进了黑色素瘤细胞的肺转移。2.Dex(100 n M)不影响黑色素瘤细胞中Rho A,Rho B,Rho C的表达和活性,却明显上调ROCK1/2的蛋白表达和活性,而不影响ROCK1/2的m RNA水平。Dex上调ROCK1/2的蛋白表达通过GR介导且Dex能够增强ROCK1/2蛋白的稳定性。细胞实验显示ROCK1/2的抑制剂Y-27632和ROCK2的抑制剂Fasudil能够阻断Dex促进黑色素瘤细胞迁移/侵袭的效应。动物实验显示Y-27632能够完全阻断皮质酮促进C57BL/6小鼠体内黑色素瘤细胞肺转移的效应,表明糖皮质激素上调ROCK1/2在糖皮质激素促进黑色素瘤的迁移,侵袭和转移过程中发挥了重要作用。3.Dex(100 n M)升高p-AKT的蛋白水平,用wortmanin抑制PI3K/AKT通路能够阻断Dex促进黑色素瘤细胞迁移和侵袭的效应,表明Dex也能通过激活PI3K/AKT信号通路,从而促进黑色素瘤细胞的迁移、侵袭。在A375细胞,用wortmanin抑制PI3K/AKT通路能够阻断Dex上调ROCK1/2蛋白表达的效应,表明激活的AKT通路参与了Dex上调ROCK1/2表达的作用,而在B16F10细胞中未发现激活的AKT通路参与到此调控作用中。4.Dex(100 n M)也能通过上调Fn表达/分泌促进黑色素瘤细胞的粘附。Dex对黑色素瘤细胞的MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-9蛋白表达无明显影响,但可下调它们的抑制性因子TIMP-2的蛋白表达。结论:糖皮质激素在体外和体内均能促进黑色素瘤细胞的迁移和侵袭。Dex上调ROCK1/2的表达和活性在其促进黑色素瘤的迁移,侵袭和转移过程中发挥重要作用。Dex在黑色素瘤细胞中还能通过激活PI3K/AKT通路介导其促进迁移和侵袭的作用。Dex上调Fn表达/分泌,促进黑色素瘤细胞的粘附,可能与Dex激活PI3K/AKT通路有关。此外,Dex下调TIMP-2的蛋白表达可能参与了其促侵袭的作用。以上结果首次揭示了作为重要应激激素的糖皮质激素在黑色素瘤进展中的作用及其机制。第二部分低氧上调巨噬细胞中小G蛋白Rho B表达的生物学意义研究背景和目的:组织低氧可以导致组织的炎症,其中免疫细胞,特别是巨噬细胞的作用不可忽视。一些研究表明,低氧微环境通过调节基因表达能够改变巨噬细胞的多种生物学行为,如细胞代谢功能,细胞运动能力,细胞凋亡,炎症因子和趋化因子表达和分泌。目前为止,低氧环境中巨噬细胞功能调控的精确机制还不清楚。Rho B是小G蛋白Rho-GTPase亚家族的成员,在细胞内许多生命活动如细胞骨架重构,囊泡和膜受体运输等过程中Rho B都起着关键的调节作用。作为即早应答基因,许多应激因素可以诱导Rho B基因的表达,如基因毒或者非基因毒应激,生长因子,细胞因子等,继而调控细胞增殖,存活和凋亡等细胞应答反应。低氧对Rho B表达的调节作用是否具有细胞类型特异性以及巨噬细胞中Rho B是否受到低氧的调节及生物学意义仍然不清楚。研究方法:细胞低氧暴露采用含有1%O2,5%CO2,94%N2的低氧培养箱;Western blot检测蛋白表达,q RT-PCR检测m RNA表达,ELISA检测炎性因子分泌,基因干扰采用含有sh RNA片段的质粒,基因过表达采用野生型Rho B质粒和组成性激活型Rho B质粒,细胞瞬时转染采用脂质体转染法和腺病毒转染法,双荧光素酶报告基因检测NF-κB转录活性,细胞粘附实验检测细胞的粘附能力,细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。研究结果:在小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞中,低氧暴露(1%O2)后能够时间依赖性且特异性的上调Rho B m RNA和蛋白的表达(不影响Rho A的蛋白表达)。与常氧环境相比,大鼠接受低氧暴露能时间依赖性的上调脾脏组织中Rho B的m RNA和蛋白表达。在RAW264.7细胞中,低氧(1%O2)能够上调HIF-1α的蛋白表达,也能够激活MAPK通路,用HIF-1α,ERK,JNK抑制剂能够阻断低氧上调Rho B蛋白表达的效应,而p38抑制剂却不能阻断该效应,表明HIF-1α,ERK,JNK的活性参与到低氧上调Rho B表达的过程中。低氧环境下,干扰Rho B的蛋白表达能够阻断低氧诱导巨噬细胞炎性因子IL-1β,IL-6,TNF-α表达和分泌的效应,还能够阻断低氧诱导的p65核转位和低氧诱导的NF-κB荧光素酶活性增加的效应。常氧环境下,Rho B野生型质粒和Rho B激活型质粒过表达能够增加p65的核转位和NF-κB荧光素酶活性,还能够增加炎性因子的表达,用Bay11-7082抑制NF-κB通路能够阻断过表达Rho B增加炎性因子表达的效应,表明Rho B通过激活NF-κB信号通路促进巨噬细胞炎性因子IL-1β,IL-6,TNF-α合成。低氧环境下,干扰Rho B的表达能够阻断低氧诱导巨噬细胞粘附增强的效应,也能够逆转低氧抑制巨噬细胞迁移的效应,表明Rho B促进巨噬细胞的粘附,抑制巨噬细胞的迁移。结论:低氧环境下,Rho B表达上调增加巨噬细胞炎性因子分泌,也有利于巨噬细胞浸润和聚集于机体缺氧的组织部位,从而维持炎症应答。我们的研究揭示了一种新的机制:Rho B通过对巨噬细胞功能的调控在低氧诱导的炎症应答中发挥关键作用。