Thermococcus eurythermalis内切核酸酶Ⅳ切割DNA中的AP位点及其类似物的机制研究

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细胞基因组的完整性和稳定性依赖于DNA复制的高保真性、DNA修复酶对DNA损伤的修复效率。DNA损伤主要是指由细胞和环境中物理和化学因素引起的核苷酸和DNA结构的改变,对细胞有潜在的诱变和毒害作用。在所有的DNA损伤中,AP位点(脱嘌呤/脱嘧啶位点)是细胞内发生频率最高的DNA损伤。AP位点由于没有碱基,在DNA复制与RNA转录中不能指导碱基的正确配对,因此严重抑制复制与转录反应或导致碱基突变。细胞内的AP位点主要经碱基切除修复重新恢复成正常碱基。在AP位点的碱基切除修复中,AP内切核酸酶是一个至关重要的酶。AP内切核酸酶作为碱基切除修复的关键酶,特异性识别AP位点,并水解AP位点5’-磷酸二酯键,断裂DNA,形成3’-羟基与5’-脱氧核糖磷酸的单链DNA缺口。自然界存在两类具有AP内切核酸酶活性的酶:外切核酸酶III与内切核酸酶Ⅳ。内切核酸酶Ⅳ是一种能够特异性切割DNA损伤的内切核酸酶,主要水解DNA中AP位点5’-磷酸二酯键。内切核酸酶Ⅳ也具有3’-外切核酸酶活性,能够去除DNA 3’-阻断基团和正常核苷酸。极端嗜热微生物面临更高频率的AP位点损伤,因此AP内切核酸酶的作用更加重要。此外,在极端嗜热微生物中,内切核酸酶Ⅳ的分布范围比外切核酸酶III广,在一些古菌中,只有内切核酸酶Ⅳ这一种AP内切核酸酶。为了进一步认识嗜热古菌的AP位点损伤修复过程与机制,本课题将以古菌T.eurythermalis内切核酸酶Ⅳ(Teuendo Ⅳ)作为研究对象,探讨它的酶学特征以及切割机制,重点研究其对AP位点及各种AP位点类似物的切割机制。我们研究结果表明Teuendo Ⅳ具有AP内切核酸酶和3’-外切核酸酶活性,利用Mg2+作为辅因子,这与前人报道的大肠杆菌内切核酸酶Ⅳ(E.coli Endonuclease Ⅳ,Ecoendo Ⅳ)将Zn2+作为辅因子不同。Teuendo Ⅳ除了可以水解天然的AP位点之外,还可以水解各种AP位点类似物(包括烷烃Spacer和聚乙二醇Spacer)的5’侧的磷酸二酯键,并对Spacer C3具有最高的催化活性。此外,AP位点的位置也能够影响Teuendo Ⅳ的切割反应。Teuendo Ⅳ能够切割3’末端一个或多个连续的AP位点,却不能切割5’末端AP位点。只有5’末端与AP位点之间存在≥2个正常核苷酸时Teuendo Ⅳ才能够发挥作用,切除AP位点。为了进一步研究Teuendo Ⅳ的切割机制,我们构建了一系列Teuendo Ⅳ的突变体并模拟了Teuendo Ⅳ的结构。研究结果表明,在Teuendo Ⅳ水解AP位点5’-磷酸二酯键时,结合底物和金属离子的残基对酶活性具有重要影响。同时,我们发现与结合DNA小沟的残基相比,结合AP位点的残基对Teuendo Ⅳ切割磷酸二酯键更加重要。Teuendo Ⅳ结构模拟结果表明Teuendo Ⅳ具有9个α-螺旋、5个R-loop和8个β折叠片。Teuendo Ⅳ模拟结构和Ecoendo Ⅳ晶体结构叠加的结果表明,与Ecoendo Ⅳ相比,Teuendo Ⅳ具有更无序的N-末端结构域。我们的研究结果为超嗜热细胞修复AP位点提供了生化基础。
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