毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白的表达,其一大优势是以甲醇为碳源,具有高密度生长的特性。其中甲醇氧化酶(AOX1)的启动子受甲醇强烈诱导,因此AOX1启动子是最常用的启动子,虽然被广泛应用,但其转录调控机制却并不清楚,而在工业生产中,往往追求蛋白产量最大化,因此有必要进一步提高AOX1启动子的活性。由于缺乏对转录机制的研究,因此通过传统的插入或删除策略往往难以获得理想活性的启动子。最新研究发现,多聚dA/dT序列可以通过影响核小体的占有率,调节转录因子与启动子的亲和力,从而调控启动子的活性;而在AOX1启动子中,也存在多个多聚dA/dT序列,本文通过修饰AOX1启动子的多聚dA/dT序列构建一系列的AOX1启动子突变体。另外,哺乳动物的肽聚糖识别蛋白PGLYRP-1是一种高度保守的模式识别分子,具有直接抑菌活性,参与调节肠道菌群的形成和维持,在食品和医药业具有潜在的应用价值,因此本文研究了猪PGLYRP-1在毕赤酵母中的表达特性,同时对猪PGLYRP-1的活性进行初步鉴定。研究结果主要分为三个部分:(1)通过Omega-PCR,对AOX1启动子中多聚dA/dT序列分别进行删除,同时在相应位点插入15 bp的多聚dA/dT序列,构建一系列启动子突变体,以猪生长激素基因(pGH)和β-半乳糖苷酶(Lac Z)为报告基因,通过Western blot和β-半乳糖苷酶酶活性分别测定胞内pGH和Lac Z的表达水平,结果表明:34个突变体的活性变化范围为野生型启动子的0.25~3.5倍;若某一位点多聚dA/dT的删除导致启动子活性降低(或活性无明显变化),那么在此位点插入15 bp多聚dA/dT序列后,可使启动子活性提高;而若某一位点多聚dA/dT的删除导致启动子活性提高,那么在此位点插入15 bp多聚dA/dT序列可导致启动子活性恢复到野生型水平或降低。另外,多聚dA/dT的缺失和长度的改变对核小体的定位和亲和力有明显影响,多聚dA/dT序列的缺失,可使其附近的核小体亲和力提高,而插入额外的多聚dA/dT序列则明显降低附近核小体亲和力,甚至出现核小体缺失。进一步研究了核小体亲和力与启动子活性的关系,发现特定区段核小体亲和力的变化与启动子活性的变化存在相关性。在(-820 to-540)区,核小体的亲和力越高,其活性就越高;在(-620 to-430)区,核小体亲和力的提高则使得启动子的活性降低;在(-585 to-185)区,过低的亲和力不利于启动子活性。综上所述,多聚dA/dT序列可作为AOX1启动子的调控元件,多聚dA/dT的删除或插入是一种行之有效的启动子突变策略。(2)根据猪PGLYRP-1成熟肽序列,进行密码子优化后,人工合成了PGLYRP-1基因;研究了基因的剂量对蛋白表达的影响,结果显示菌株中含有高拷贝PGLYRP-1基因不利于蛋白的分泌表达,而细胞内聚集大量未折叠蛋白,由此引起未折叠蛋白应答反应;为了促进PGLYRP-1蛋白的分泌表达,选择共表达分子伴侣PDI和BiP,结果表明共表达PDI可以提高高拷贝菌株中PGLYRP-1蛋白的分泌水平,同时减少胞内未折叠蛋白的含量,而过表达BiP则不能提高PGLYRP-1的分泌水平,进一步检测各基因mRNA水平,在高拷贝菌株中PDI和BiP过量表达可降低PGLYRP-1的mRNA水平;综上,在高拷贝菌株中,PDI一方面可以促进PGLYRP-1蛋白的折叠,另一方面又可以在转录水平上,下调PGLYRP-1的表达;而BiP虽不能促进蛋白分泌,但亦可下调PGLYRP-1的mRNA水平,由此减少内质网中过量外源蛋白造成的毒性。(3)利用25 L发酵罐对重组毕赤酵母进行高密度发酵,从发酵上清中分离纯化重组PGLYRP-1蛋白,并对其活性进行了初步鉴定。结果显示:猪PGLYRP-1蛋白的表达量与菌体量并不成正比。当发酵上清液中PGLYRP-1蛋白积累到一定量时,蛋白开始发生聚集,其表达量为25 mg/L;重组PGLYRP-1蛋白均可与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌结合,具有一定的抑菌能力。本研究为猪PGLYRP-1蛋白的大规模生产及活性研究奠定了一定基础。