论文部分内容阅读
花色素苷(Anthocyanin)具有抗癌,抗炎等功能,大量应用于食品、医药等各方面,同时花色素苷在植物花卉花色研究中有重要意义,因此花色素苷生物合成调控的研究已成为近年来的热点。花色素苷的生物合成除了受其途径上关键酶基因的影响,还受到转录因子的调控。MYB转录因子(MYB transcription factor,MYB)是植物中最大一类转录因子家族之一,前人的研究表明MYB不仅参与初生代谢的调控,也会参与次生代谢的调控。其中R2R3类型的MYB(R2R3-MYB)是植物中调控花色素苷生物合成的重要转录因子。许多茄科植物都是具有经济价值的作物,如粮食作物马铃薯(Solanum tuberosum)、蔬菜作物番茄(Solanum lycopersicum)、药用植物颠茄(Atropa belladonna)等。颠茄隶属于茄科颠茄属,颠茄成熟果实的果皮、果肉富含花色素苷而均呈现为黑紫色。而其他茄科作物如番茄、辣椒(Capsicum annuum)和茄子(Solanum melongena)等的果肉一般不含或含有极少量花色素苷,表明在药用植物颠茄中可能会存在特定的R2R3-MYB转录因子参与其花色素苷生物合成的调控。为从茄科植物中发掘可用于花色素苷生物合成代谢工程研究的MYB转录因子,本研究从颠茄中鉴定了一个R2R3-MYB转录因子(AbMYB1),通过基因表达分析和转基因等方法鉴定了该转录因子在调控花色素苷中的功能,具体研究内容和结果如下:1.AbMYB1基因克隆与生物信息学分析采用PCR技术克隆获得AbMYB1的c DNA全长为1035 bp,包含一段762 bp的编码区,编码254个氨基酸。进化分析结果表明,AbMYB1与调控花色素苷生物合成的MYB转录因子Sn MYB和Ph DPL亲缘关系更近。氨基酸序列多重比对分析表明,AbMYB1具有R2R3型MYB转录因子序列保守结构域,属于R2R3-MYB转录因子。2.AbMYB1组织表达模式分析通过荧光定量PCR技术分析了AbMYB1在野生型颠茄的根、茎、叶、花、绿果和成熟果中的表达水平,结果表明:AbMYB1在花、绿果和成熟果中大量表达,且在成熟果中表达量最高,但在根、茎和叶中表达量极低。3.颠茄果实不同发育时期花色素苷生物合成相关基因的表达分析为了分析颠茄果实发育进程中花色素苷生物合成相关基因的表达变化,本研究选取了幼果、绿果、破色果、紫果和成熟果五个不同时期的果实进行荧光定量PCR检测。结果表明AbMYB1、Ab CHS、Ab CHI、Ab F3H、Ab F3’H、Ab F3’5’H、Ab DFR和Ab ANS在果实破色时期表达量最高,在成熟期仍有高水平表达;Ab3GT在果实破色时期表达量也很高,但在果实成熟期表达量达到最大值。这些结果表明AbMYB1在颠茄果实不同发育时期的表达变化与花色素苷的积累呈正相关性。4.通过转基因颠茄研究AbMYB1调控花色素苷生物合成的功能为了进一步探究AbMYB1在花色素苷生物合成途径中的调控功能,本研究构建了过表达/干扰AbMYB1植物表达载体,通过农杆菌介导,分别转化颠茄外植体获得再生苗,通过基因组PCR和荧光定量PCR鉴定获得了过表达/干扰AbMYB1的相关转基因材料。本研究提取了野生型颠茄株系和过表达/干扰AbMYB1转基因颠茄株系的叶、花、成熟果中的花色素苷,并用紫外分光光度计检测了花色素苷的含量。并在分子水平上,通过荧光定量PCR技术鉴定了过表达/干扰AbMYB1对转基因颠茄植株的花色素苷生物合成途径相关基因表达量的影响。检测结果如下:1)与野生型颠茄株系相比,过表达AbMYB1颠茄株系在花和成熟果中花色素苷含量显著增加,分别提高了3-5倍、1-2倍,并且在叶片中检测到了花色素苷。过表达AbMYB1株系与野生型株系相比:在过表达AbMYB1株系的叶片中,花色素苷生物合成相关基因AbMYB1、Ab F3H、Ab F3’5’H、Ab DFR、Ab ANS和Ab3GT表达量显著增加;在过表达AbMYB1株系的花中,Ab CHS、Ab CHI、Ab F3H、Ab F3’5’H、Ab DFR、Ab ANS、Ab3GT表达量显著增加;在过表达AbMYB1株系坐果13天的果实中,Ab CHS、Ab CHI、Ab F3H、Ab F3’5’H、Ab DFR、Ab ANS和Ab3GT表达量都显著上调;而在成熟果中,过表达AbMYB1株系中只有AbMYB1和Ab3GT的表达量显著增加。2)干扰AbMYB1颠茄植株中花和成熟果的颜色呈现淡黄色,花色素苷含量极低,与野生型颠茄相比显著降低;在干扰AbMYB1株系的花中,AbMYB1、Ab F3′5’H、Ab DFR和Ab3GT的表达量显著降低;在干扰AbMYB1株系坐果13天的果实中,AbMYB1、Ab DFR、Ab F3H、Ab F3’5’H和Ab ANS表达量显著降低;在干扰AbMYB1株系的成熟果中,AbMYB1、Ab CHS、Ab CHI、Ab F3H、Ab F3’5’H、Ab DFR、Ab ANS和Ab3GT表达量显著降低。综上所述,AbMYB1是一个R2R3-MYB转录因子,主要在颠茄花和果中调控花色素苷生物合成途径基因的表达,从而影响花色素苷的生物合成。本研究为进一步探究茄科植物的花色素苷生物合成途径提供了一定的理论依据,并为花色素苷代谢工程研究提供了一个候选基因。