自从虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾(Penaeus monodon)中被发现以来,越南、印尼、马来西亚和泰国等国家均有检测出EHP对凡纳滨对虾的感染,对虾感染该病原后,会出现生长缓慢或生长停滞,有时会出现白便等症状,但其摄食和存活率不受影响。本实验室最早也于2013年从浙江台州养殖的日本囊对虾、凡纳滨对虾以及罗氏沼虾样品中检出了EHP的感染,当对虾肝胰腺中EHP SSU rDNA的相对拷贝数在10~3 copies/(ng HpDNA)数量级或EHP载量指数在3以上时,对虾的生长明显较慢,表明该载量的EHP已处于一个较高的风险水平,其导致对虾生长缓慢的问题给对虾养殖业带来了巨大损失,需要引起高度重视。本研究对EHP的流行病学进行了更深层次的研究,运用了孢子纯化、荧光染色、TaqMan qPCR、原位杂交等技术手段,旨在了解EHP的更多信息,以期对该病的感染机制和防控策略提供技术依据。主要包括以下研究内容:1虾肝肠胞虫(EHP)孢子的分离纯化与计量孢子是EHP进行个体和群体间传播的关键方式,研究其提纯和计量的方法能为EHP的传播风险评估及防控研究提供技术支持。本研究应用差速离心和密度梯度离心,从感染EHP对虾的肝胰腺中,尝试纯化出孢子,并应用透射电镜、荧光桃红B染色和血球计数板计数等方法对纯化出的孢子进行了观察和计量。结果表明,从4 g的EHP载量为(4.7±2.2)×10~4 copies/ng DNA的肝胰腺组织中离心得到了EHP的孢子,电镜和显微染色观察孢子为0.7—1.2μm的椭圆形颗粒,纯化孢子悬液用血球计数板计数显示孢子浓度为5.30×10~3个/μl,蔗糖密度梯度中的纯化孢子区带含有的孢子总数约1.06×10~6个。TaqMan qPCR定量孢子悬液的拷贝数为2.535×10~3 copies/ul。2荧光染料检测虾肝肠胞虫(EHP)的可行性研究荧光染料用于微孢子虫的检测已在多个物种中取得好的效果,但EHP中尚无此类研究。为了探究荧光染料检测EHP的可行性,我们首次采用了PI、Sytox Green和Calcofluor White等染料染色纯化后的孢子,结果显示:Calcofluor White染色的孢子观察效果最佳,染色后的孢子在荧光显微镜下可发出强烈的白色荧光,而寄主组织碎片、病毒、细菌等不被染色。将该染料用于感染EHP对虾的粪便、肝胰腺研磨液和各个组织切片的染色,均出现相同的白色荧光信号,其中粪便和肝胰腺切片的染色效果最明显,相较于HE染色的切片具有更高的辨识度。为了验证检测结果的正确性,对显示荧光信号的样品进行了EHP原位LAMP和巢式PCR,结果均为阳性,而没有显示荧光信号的样品,检测结果均为阴性。因此,荧光染料检测EHP是可行的,且用Calcofluor White染色粪便和肝胰腺切片来检测对虾是否感染是最简单可靠的方法。3对虾生物饵料中虾肝肠胞虫(EHP)携带情况的调查生物饵料在对虾亲虾养殖和育苗阶段起着关键作用,为了调查饵料生物中是否有EHP的感染或携带,本研究于2018年9月—2018年12月,赴浙江和海南采集了多批生物饵料样本,样品包括:沙蚕和虾片,提取了样品核酸并进行了EHP的检测。结果显示:102份沙蚕样品中,出现了3个弱阳性,其余均为阴性;9份虾片样品中发现5份弱阳性。对阳性沙蚕样品进行了EHP的原位LAMP,结果只有一个样品出现了微弱的杂交信号。对阳性虾片样品进行人工投喂感染试验,连续投喂20天后,结果均为阴性。该结果说明:生物饵料可能会成为一种潜在的风险,在育苗或养殖过程中作为病原携带者传播病原,但低载量或超低载量的携带者并不足以传播EHP。4虾肝肠胞虫(EHP)防控药剂的效果评价目前,我国EHP的感染率依然很高,其对我国的虾类养殖业造成的危害越来越大,生产上急需能高效预防和杀灭该病原的药剂。本研究在之前研究的基础上进行了更多的药剂的筛选试验,并对药物进行了合理的包裹,使其在水中的扩散时间显著降低。本研究分别用鸡蛋清、明胶、牛油、猪油、海藻酸钠和食用油对均匀染色的饲料进行了包裹,通过测定不同时间段水中染料的OD值判断扩散程度来评价包裹材料的效果。结果显示:在浸泡10 min、20 min和30 min后,裹有明胶的饲料水中OD值最小。因此本研究将明胶作为包裹材料用于药物的筛选试验。本研究在先前的基础上新增了17种药物的效果评价,通过EHP感染模型和荧光定量PCR方法最终检测到编号为:T2、T4、J7和F27的4种能降低EHP载量的药物,实践了药物处理对EHP载量影响的测试方法。