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微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由淡水蓝藻产生的一类单环七肽天然毒素。在MCs众多的异构体中,MC-LR是分布最广且毒性最强的一种。近年来,随着水体富营养化的加剧,蓝藻水华频频发生,MCs被持续不断地释放入水体,导致许多水体都面临MCs污染。WHO在1998年强制规定饮用水中MCs限量为1 Hg/L。而在我国太湖水域,蓝藻水华暴发季节检测到其水体中的MCs含量高达15.6 μg/L,约为WHO规定限量的16倍。研究表明MCs具有肝、肾、神经毒性,可造成胃肠道组织病理学改变。近期本实验室通过急性、亚急性动物实验,率先发现MCs具有很强的雄性生殖毒性,可造成大鼠睾酮水平下降,精子质量受损和睾丸结构的破坏。而我们日常接触到的MCs以低剂量为主。基于此,本研究以小鼠为实验对象,以WHO推荐生活饮用水MCs最高含量lμg/L为参照,以自然饮水方式,对其进行长期低剂量染毒,观察和评估MC-LR是否会对雄性小鼠生殖系统产生毒性效应。另外,实验室前期研究发现,MC-LR可造成睾丸支持细胞凋亡,而近期有文献报道,自噬参与了 MC-LR导致的非洲绿猴肾细胞系的损伤,并且和细胞凋亡的发生密切相关。因此,我们以支持细胞中的自噬和凋亡为切入点,通过体外实验进一步探讨MC-LR雄性生殖毒性的机制。第一部分长期低剂量染毒MC-LR对雄性小鼠生殖系统的影响一、目的通过体内实验,探讨长时期低剂量染毒MC-LR对雄性小鼠生殖系统的影响。二、方法1、160只雄性BALB/c小鼠(15-20克)随机分为2个大组(3个月组和6个月组),每个大组有4个小组:1个对照组和3个实验组,每小组20只小鼠。在实验组中,小鼠饮用水中MC-LR含量分别为1 μg/L、3.2 μg/L和10μg/L。对照组中,小鼠喂养不含MC-LR的正常饮用水。分别于3个月和6个月后,眼球取血后断颈处死小鼠,并取各脏器备用。2、常规方法称取小鼠体重、睾丸湿重、饮水量;放射免疫法测定血清中三种生殖内分泌激素:睾酮(Testosterone,T)、黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)和卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)的水平;附睾头精子计数及精子活动率、精子畸形率检测;制作睾丸石蜡切片,H&E染色,光学显微镜下观察;TUNEL检测睾丸细胞凋亡情况。三、结果1、MC-LR染毒3个月,染毒组与对照组相比体重净增长、睾丸湿重及饮水量没有明显差异;MC-LR 10 μg/L组小鼠血清T水平出现下降趋势,LH、FSH水平出现上升趋势;3.2μg/L和10 μg/L组小鼠附睾精子质量显著下降(P<0.05);睾丸组织学检测发现10 μg/L组小鼠生精上皮略有松散;TUNEL检测发现高浓度组睾丸细胞凋亡略有增加。2、MC-LR染毒6个月,染毒组与对照组相比体重净增长、睾丸湿重及饮水量没有明显差异;3.2μg/L和10 μg/L组小鼠血清的T水平显著下降(P<0.05),LH、FSH水平明显显著上升(P<0.05),小鼠附睾精子质量极显著下降(P<0.01),呈现时间-剂量依赖效应;病理切片可见,3.2 μg/L组睾丸中生精上皮稍有疏松,10 μg/L组生精上皮变薄,管壁细胞脱落,生精细胞排列紊乱,管腔中几乎没有成熟的精子。TUNEL检测发现3.2μg/L和10μg/L组睾丸细胞凋亡显著增加(P<0.05)。四、结论1、长期低剂量自然饮水方式对雄性小鼠染毒MC-LR,其基本生理指标没有显著变化。2、MC-LR可抑睾酮合成,降低小鼠血清睾酮水平,进而影响其精子发生。3、MC-LR可破坏睾丸组织结构,导致细胞凋亡增加,最终使精子发生受到严重的损伤。第二部分MC-LR对原代培养的睾丸支持细胞自噬和凋亡的影响一、目的通过体外实验,探讨MC-LR对睾丸支持细胞的毒性作用,并以睾丸支持细胞自噬和凋亡为切入点,进一步研究MC-LR对雄性生殖系统的毒性作用机制。二、方法1、取出生28天的SD大鼠睾丸,采用改良方法分别以0.25%胰蛋白酶、0.1%胶原酶对其进行消化,分离得到睾丸支持细胞和生精细胞的混合液。培养48 h后,经PBS冲洗,继续培养24 h后即得到纯度较高的睾丸支持细胞。2、睾丸支持细胞分为5组进行各项指标的检测,即0、0.5 nM、5 nM、50 nM、500 nM MC-LR 组。3、利用免疫荧光法和蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测MC-LR是否进入睾丸支持细胞。4、采用CCK-8法检测细胞活力,LDH试剂盒检测MC-LR对细胞膜完整性的影响。5、采用透射电镜(TEM)和免疫荧光法检测睾丸支持细胞中自噬的发生。6、采用聚合酶链式反应(PCR)、Western blot和免疫荧光法检测MC-LR对睾丸支持细胞自噬水平的影响。7、采用Western blot和免疫荧光法检测MC-LR对睾丸支持细胞自噬和凋亡相关基因和蛋白表达的影响。三、结果1、通过免疫荧光法和Western blot发现MC-LR能进入睾丸支持细胞。2、CCK-8法检测细胞活力发现:分别染毒MC-LR 24 h和48 h后,50 nM和500 nM显著降低了支持细胞活力(P<0.05)。LDH试剂盒检测MC-LR对支持细胞膜完整性的毒性效应发现:分别染毒MC-LR24 h和48 h后,50 nM和500nM显著提高了支持细胞LDH的释放率(P<0.05)。3、睾丸支持细胞经诱导自噬的饥饿培养处理后,免疫荧光法和透射电镜观察到细胞中自噬的存在。4、PCR、Western blot和免疫荧光结果显示MC-LR能够影响睾丸支持细胞中自噬的水平。支持细胞经MC-LR染毒24 h和48 h后,自噬标志性蛋白LC3的mRNA表达在低浓度条件下(0.5-50nM,24h和0.5-5nM,48h)升高,高浓度(50-500 nM,48 h)显著下降;蛋白水平和免疫荧光显示在染毒24h后持续上升,48 h上升到50 nM达最高峰,500 nM不再上升。同时自噬上游的负调控蛋白p62在高浓度MC-LR(50-500nM,48h)条件下,mRNA表达水平显著下降,蛋白水平显著升高。5、Western blot和免疫荧光结果显示:高浓度(50-500 nM)MC-LR染毒支持细胞48 h后细胞中自噬水平(LC3II)和饥饿组、自噬激活组的自噬水平皆显著高于对照组,且高浓度MC-LR染毒组中的自噬水平超过了饥饿组和自噬激活组;经自噬抑制剂CQ(抑制自噬体与溶酶体融合)处理后,50-500 nM MC-LR条件下,支持细胞中自噬水平介于饥饿和自噬激活组之间,皆显著高于对照组。溶酶体相关蛋白LAMP-1表达水平随MC-LR染毒浓度的增加(0、0.5、5、50、500 nM)和染毒时间的延长(24、48 h)显著性下降。6、Western blot结果显示:支持细胞中Cyt C和caspase 3在高浓度MC-LR(50-500 nM)条件下表达都显著升高(P<0.01),Bcl-2的表达在高浓度MC-LR(50-500 nM)染毒48 h后显著下降(P<0.01),Bax的表达没有随MC-LR浓度增加而变化。经自噬抑制剂3-MA处理后,细胞中与自噬和凋亡相关的数据(包括细胞活力、LDH的释放率、Cyt C、caspase 3、Bcl-2和Bax)不再随MC-LR浓度的增加而变化。四、结论1、MC-LR能够进入睾丸支持细胞并且能够造成细胞活力的下降和细胞膜完整性的破坏。2、睾丸支持细胞中存在自噬。3、低剂量MC-LR(0.5-5 nM)染毒睾丸支持细胞后,即可诱导细胞中的自噬,高剂量MC-LR(50-500 nM)通过损伤溶酶体功能,表现为LAMP-1蛋白表达的下降,进而造成细胞中自噬体的堆积,表现为p62的堆积。4、堆积的自噬体能够通过下调Bcl-2的水平进而诱导睾丸支持细胞的凋亡。