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碳青霉烯类药物是人医临床治疗严重细菌感染的最重要抗生素之一,NDM酶的出现及在临床分离菌中广泛传播引起了人们的极大关注。虽然在我国碳青霉烯类药物并未批准用于动物,但在食品动物中也陆续发现产NDM酶的肠杆菌,有通过食物链传播给人的风险,因此有必要对blaNDM基因在我国食品动物源肠杆菌的流行分布和传播机制开展系统的研究。本研究对国内主要动物养殖地区随机分离的食品动物源大肠杆菌开展碳青霉烯类药物耐药性调查、耐药机制和传播机制研究,以揭示blaNDM基因在我国食品动物源大肠杆菌中的流行分布和传播特征。20132017年间从国内共计14个省市的猪、鸡分离的12489株大肠杆菌为研究对象,采用琼脂稀释法测定受试菌株对17种抗生素的敏感性,结果显示受试菌株对亚胺培南耐药率最低,仅为0.36%（n=45）,其中猪、鸡源大肠杆菌分别为0.42%（n=37）和0.22%（n=8）;其次是阿米卡星、头孢他啶和头孢西丁,均低于10%。对四环素耐药率最高（91.1%）,其次是复方新诺明（82.7%）、氨苄西林（81.1%）和多西环素（76.2%）。通过比较亚胺培南耐药菌和全部菌对17种抗生素的耐药率,结果显示耐亚胺培南菌株对黏菌素（71.1%）、阿米卡星（33.3%）、磷霉素（42.2%）等抗菌药的耐药率显著高与全部菌的耐药率。采用PCR和测序方法对亚胺培南不敏感菌株检测blaNDM基因,结果显示20152017年45株耐药菌全部为blaNDM阳性,共检测到5个NDM亚型,分别为NDM-1（n=36）、NDM-5（n=6）、NDM-7（n=1）、NDM-9（n=1）和1个新的NDM-23型。45株blaNDM阳性大肠杆菌中有30株同时检测到mcr-1基因,阳性率高达66.7%。采用MLST、PFGE、S1-PFGE、Southern杂交、接合转化和复制子分型的方法从垂直和水平传播两方面研究blaNDM基因的传播机制。45株blaNDM阳性菌分为30个不同ST型,其中ST10型有8株,是优势克隆群。对ST10型大肠杆菌采用PFGE方法进一步确认其克隆关系,结果显示仅有3株属于同一克隆株,说明blaNDM在大肠杆菌的扩散不是以克隆传播为主。45株blaNDM阳性菌中,有44株大肠杆菌的blaNDM基因可以通过接合转移,另外1株可通过转化实验发生转移,对所有接合子进行转化实验并获得单质粒转化子。复制子分型结果显示有5种质粒型,包括F33:A-:B-（n=32）、IncX3（n=10）、F2:A-:B-（n=1）、IncY（n=1）和1株不可分型质粒,其中F33:A-:B-和F2:A-:B-型质粒全部来自河南的样品,IncX3质粒分布的地域广泛。S1-PFGE和Southern杂交显示,IncFII质粒大小在80 kb左右,IncX3质粒大小为46 kb,IncY和不可分型质粒大小分别为100 kb和120 kb。PCR结果显示blaNDM共有四种基因环境,F33:A-:B-和F2:A-:B-质粒中存在相同的基因环境,说明blaNDM基因可能在F33:A-:B-和F2:A-:B-质粒之间发生了转移。选取F33:A-:B-、IncX3、IncY和不可分型的blaNDM阳性质粒测序。结果显示F33:A-:B-质粒pHNP071具有典型的F33:A-:B-质粒骨架,耐药区插入位点与质粒pHN7A8相同,质粒pHNP071可能是由hp-hp-ISAba14-aphA6-ISAba125-blaNDM-trpF-tat-hp-tnpR的结构替换了pHN7A8中△ISEcp1-blaCTX-M-65-IS903-iroN-△Tn1721而形成。测序的三个IncX3质粒（pHNAH611、pHNAH566、pHNAH699）骨架序列高度相似,可变区插入在umuD基因中,通过对其余7株IncX3质粒转化子可变区检测发现,全部与pHNAH611的相似。IncY型质粒pHNSD133T属于类噬菌体质粒,具有与P7噬菌体相似的骨架结构,为首次在IncY型质粒中发现blaNDM-1基因,复合型1类整合子sul1-qacE?1-arr-3-catB3-ΔISAba125-blaNDM-1-ble-trpF-ISCR1-aadA16-dfrA27-arr-3-aac（6’）-Ib-cr-intl1的整合可能是其获得blaNDM-1基因的途径,同时可以介导多种耐药基因的共转移。pHNSD138-1属于IncK2质粒,IS26-?ISAba125-blaNDM-9-bleMBL-trpF-tat-?catA-ISCR1-qacE?1-sul1-aad2-gcuF-dfrA12-intI1-IS26结构可能是blaNDM-9基因水平转移的主要结构。为进一步了解blaNDM阳性质粒的生物学特征,对不同型的质粒检测适应性代价、稳定性和接合频率。结果显示,F33:A-:B-质粒pHNP071、pHNP014、pHNP026的相对适应性指数在1.051.20之间,说明F33:A-:B-质粒的获取可以使宿主菌获得竞争优势,IncX3质粒pHNAH699、pHNGD073和IncK2质粒pHNSD138-1相对适应度在0.941.00之间,说明IncX3和IncK2质粒仅对宿主产生较低的适应性代价,IncY型质粒pHNSD133T则会产生较大的适应性代价。稳定性实验结果表明,IncK2、IncX3和F33:A-:B-质粒都可以在宿主菌中稳定存在,IncY型质粒pHNSD33T1在连续传代14天后质粒丢失率为16%;接合频率结果显示F33:A-:B-、IncX3、IncK2质粒接合频率分别是10-510-1、10-310-5和10-5。综上所述,我国食品动物源大肠杆菌耐药情况严重,对碳青霉烯类药物的敏感性较好,NDM酶的检出率为0.36%,其中NDM-1和NDM-5在我国最流行。blaNDM基因存在克隆传播,但主要以质粒水平转移为主,F33:A-:B-质粒在河南地区介导blaNDM的区域性流行,IncX3质粒分布区域较广泛,在IncK2和IncY质粒上首次检测到blaNDM基因。通过对不同blaNDM阳性质粒的生物学特性研究表明,F33:A-:B-质粒具有接合频率高、稳定性好和竞争力强的特点,有导致blaNDM基因在动物源细菌中广泛流行的风险。食品动物源大肠杆菌中出现blaNDM基因,有加速传播的风险。