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一、目的与背景 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括单纯性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化。其中NASH是NAFLD进展的重要中间阶段,也是隐源性肝硬化的重要病因。NAFLD是一种病变主要在肝小叶,以肝细胞脂肪变性和脂肪过多贮积为病理特征但无过量饮酒史的临床综合征。NAFLD最常见病因为肥胖、2型糖尿病和高脂血症。NAFLD的患病率逐年上升,趋向于超过病毒性肝炎和酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD),已成为全球普遍关注的医学问题和社会问题。全球流行病学调查表明,NAFLD的患病率大约为17～33%。最近,范建高等对上海市3175例成人调查发现NAFLD患病率为15.4%。NAFLD发病机制尚未完全阐明,主要涉及肝细胞内游离脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)蓄积、细胞变性坏死、炎症细胞浸润以及肝纤维化等诸方面。 固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs)是控制肝脏胆固醇(Chol)、脂肪酸(FA)和甘油三酯(TG)等脂质代谢有关的酶的重要转录因子,SREBP有3种异构体:SREBP-1a、-1c和-2。其中,SREBP-1c是调控肝脏FA和TG合成有关基因的主要转录因子,与肝细胞内TG的过度蓄积产生脂肪毒性和胰岛素抵抗(IR)的发生密切相关。SREBP-1c能通过FFA上调细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes,CYP)4A10、4A14和2E1的表达,后三者则与脂肪酸的肝内氧化应激和脂质过氧化作用等密切相关,可引起肝脏炎症反应而发生NAFLD/NASH。浙江大学硕士学位论文 本实验通过高脂饮食建立大鼠NAFLD模型,用R工PCR方法检测SREBP一Ic、CYP4AIO、CYP4A14和CYPZEI mRNA在NAFLD大鼠中的表达水平,探讨其在NAFLD发病机制中的作用。二、材料与方法1.动物分组和模型的建立:采用健康、性成熟、一级质量标准的雄性SD大鼠 30只(由浙江省动物实验中心提供),体重约25仆一3009,随机分为3组,每组 10只。I组为正常饮食组;II和m组均为高脂饮食组(高脂饲料配方如下:10% 猪油+2%胆固醇十78%普通饲料),饲养时间分别为1月和6月。各组大鼠实验 期间均予以自由饮食和饮水。造模1一6月后全部处死动物,称体重,股动脉 放血收集外周血;同时取肝活组织做肝匀浆和石蜡切片,部分放于一80℃冰箱 保存留于Rl’- PCR之用。2.血浆生化测定:在全自动生化分析仪中检测肝功能和血脂的水平。3.肝脏病理学检查:大鼠肝脏组织进行固定、包埋、切片和HE染色。切片于 60℃烤片1小时后置于二甲苯中脱蜡一梯度酒精中脱水一蒸馏水水洗~苏木 素染色8分钟~蒸馏水水洗~75%酒精分化一伊红染色3秒一蒸馏水水洗一 二甲苯透明、封片。光镜下观察肝组织病理变化。4.肝匀浆检测:用Rl’- pCR法检测SREBP一1。、C钾4AIO、CYP4A14和CYPZEI mRNA的表达水平。方法:肝匀浆总RNA提取采用TRIzol试剂一步提取法, P工PCR逆转录cDNA合成按GIBCOBRL公司M一MLV逆转录酶试剂盒说明 书进行,一20℃保存,加入相应的引物进行PCR扩增。SREBP一IC上游引物5’ 一CTG CTG CTG ACA GCT GTA AA一3’,下游引物5’一AGC GCT TCT CAA TGG CAT TG一3’,扩增片段为258bP:CYP 4A10上游引物5,- CGT CTA CAG ATTGCTAGCTC一3’,下游引物5’.GCACACTTC户L1…GACAGTGTC一3’,扩 增片段为249bp;CYP4A14上游引物5’一CTT GAT GAC ACT GGA CAC TG 一3’不游引物5,- ACT CCA TCT GTG TGC TCA TG一3’扩增片段为228bP; CYP 2EI上游引物5’一TCAAGGAGGTGCTGCTGAAC一3’,下游引物5’一Al,G GcT Tcc AGG TAG GTA TC一3’,扩增片段为44ObP;GApDH为内参照,上游浙江大学硕士学位论文引物5’一CAf GGT CTA CAT GTT CCA GT一3’,下游引物5’一GGC工AA GCAGTT GoT oTToc一3’,扩增片段为349bP。PeR过程:2林l模板,0.5林11’aq酶,各自的上下游引物各0.5贝,lomM dNTPO.4闪,25mM Mgc广1.2闪(终止浓度为1.smM)及10Xbu到七rZ川,加水至终体积20川。94℃变性3分钟,以后94℃30秒一GAPDH、CYP4A10 56℃30秒、CYPZEI 54oC30秒和CYP4A14、SREBP一Ic52℃30秒一72℃30秒,共30个循环,72℃3分钟终止反应。取5川PcR产物经2%琼脂糖凝胶(含0.5林创ml澳化己锭)电泳,所得目标条带用BloRAD凝胶成像系统拍照,用伽训ityone软件测定其光密度值。5.统计学处理:数据用SPSS13.O统计软件进行分析,组间均数用t检验,相关性分析采用Pearson相关性分析。三、结果1.3组大鼠肝功能、血脂及肝脏病理学的变化:(l)肝功能和血脂:11和111组大鼠ALT(1 34.08士80.62,206.75士177.16)、 AST(286.75士79.03,356.25士160.29)、Glb(26.91士2.37,28.63士2.10)、 刀G(0.58士0.07,0.59士0.07)和Chol(2.49士0.36,3.01士0.75)均比I组大鼠 (ALT:54.75士7.05,AST:200.33士14.49, Glb:42.06士6.05沪以G:0.75土 0.的,C hol:1.62士0.16)升高,有显著性或非常显著性差异(均P<0.05或 P<o,01)。111组To(0.47士0.10)比I组(0.35士0.05)升高,有非常显著性差异 (P<0 .01)。(2)肝脏病理学变化:11和m组大鼠肝小叶结构不清,肝细胞肿胀,肝细胞呈脂肪 变性;肝小叶内和汇管