研究背景近年,全球罹患糖尿病（diabetes mellitus,DM）的人数激增,在我国,DM患者人数俨然跃居全球首位,广大患者的健康问题受到严峻挑战,生存质量受到严重侵害。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是DM的主要慢性并发症,虽然许多大型临床研究,如DCCT和UKPDS等均显示,强化降糖、降压、调脂等治疗能显著减少尿蛋白,但DN发生发展的剩余风险仍高达50%-86%。目前,DN已成为中国住院患者罹患终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的首位致病原因。指南推荐的DN治疗主要是抗肾素（renin）-血管紧张素（angiotensin）-醛固酮（aldosterone）系统（RAAS）治疗,但其获益有较大的局限性,减少ESRD的证据不足,ESRD不断增长的发病率提示我们DN存在的潜在的发病机制仍有待探索。因此当前,我们亟需进一步明确DN的新的发病机制及干预靶点,以期为DN患者提供更佳的治疗方式。国内外针对DN发病机制的研究一直是热点,当前针对DN源头病变理论存在争议。既往,专家们多认为,DN主要由肾小球病变所致,但之后,越来越多的证据表明,肾小管病变在DN的发生发展,尤其是早期病变过程中发挥关键作用。肾小管病变对早期肾功能的影响更为密切。通常,人体肾小球每天滤过约3.3g白蛋白,其中约97%由肾小管重吸收以至于仅3%的白蛋白最终随尿液排出。在参与白蛋白重吸收中起主要作用的为近端肾小管上皮细胞（proximal renal tubular epithelial cells,PTECs）,其可重吸收滤过白蛋白的71%。在DN的发病过程中,PTECs可先于肾小球发生损伤,即,肾小管重吸收功能异常先于肾小球滤过功能障碍。肾小球滤过膜是一种高度分化的血液滤过性屏障,在保持体内的水、电解质和酸碱平衡中发挥重要的作用。因而,肾小球损伤被视为DN蛋白尿发生和进展中的主要原因。足细胞（podocyte）是肾小球滤过膜的最后一道屏障,在DN中扮演重要角色,也是DN肾内平衡紊乱中最薄弱的环节之一。研究表明足细胞病变与DN蛋白尿发生密切相关。而我们前期通过构建DN大鼠模型,发现在早期DN大鼠的肾脏中存在明显凋亡的PTECs,与之形成鲜明对比的是,此时凋亡的肾小球细胞却极少出现,即早期DN中,凋亡的肾小管先于肾小球出现。Bim是Bcl-2蛋白家族成员,其是一种仅含有一个Bcl-2的同源性（BH3）结构域的促凋亡蛋白,在细胞死亡途径的激活中起重要作用。我们前期通过体外功能实验进一步明确了 Bim蛋白是介导PTECs早期凋亡的关键因子。当前绝大多数针对DN的机制研究都是立足于一个点,如:单纯针对足细胞、肾小管上皮细胞等单一细胞病变在DN中的作用,忽略了肾脏作为一个组织整体,细胞间信息交流在病变发生发展中同样具有重要作用。当前,细胞间交流作用促DN发生发展越来越受到广泛关注。肾单位中,肾小球和肾小管分别发挥滤过和重吸收的功能,而作为两者中最具代表性的两类细胞,肾小球足细胞与PTECs无疑分别是上述功能的有力执行者。目前,针对两者间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN发生的机制尚不明确,仍需进一步探索。足细胞骨架改变是造成DN早期足细胞病变的主要原因,同时也是诱发早期DN蛋白尿的重要因素。因此,阐明足细胞骨架病变的发病机制,延缓并阻止肾小球滤过屏障损伤,成为防治DN的重要环节。另有研究发现,不仅局限于介导凋亡作用,Bim还可诱导细胞因子分泌发挥促凋亡外的其他作用。那么,我们前期发现的促肾小管凋亡的Bim蛋白是否可通过调控某种因子诱导肾小球足细胞骨架损伤,进而致DN进展的作用未见报道。本部分研究以此为重点,拟探索肾小管Bim蛋白介导的管球交流致DN足细胞损伤的作用及分子机制。研究目的1.通过构建PTECs与足细胞体外共培养模型,明确高糖下PTECs致足细胞损伤作用,即管球交流作用的存在。2.明确高糖下PTECs介导足细胞骨架损伤的分子作用机制。3.通过构建体内DN小鼠模型,于体内探究肾小管Bim介导DN足细胞骨架损伤作用。研究方法1.最佳高糖浓度及处理时间筛选:设置不同糖浓度梯度及时间梯度处理人足细胞,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达情况以确定最佳高糖浓度及高糖最佳处理时间。2.RT-PCR及Western blot:明确高糖处理PTECs 48 h后Bim mRNA及蛋白表达水平。3.下调Bim慢病毒转染PTECs构建稳转细胞株:（1）转染下调Bim慢病毒,构建稳定转染细胞株:1)慢病毒感染预实验,感染复数值（MOI）筛选及感染最佳时间确定:设置不同病毒感染复孔,向PTECs（人HK-2细胞株）转染慢病毒。当达到80%的转染效率时,观察细胞生存情况,以此为依据记录转染条件及MOI值以备正式实验所用。2)慢病毒感染正式实验:应用病毒感染预实验得到的感染条件进行正式实验,对细胞进行长达约72小时的感染后,将其置于荧光显微镜下观察荧光表达情况以明确感染效率。（2）嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株:设置不同浓度的嘌呤霉素进行药物浓度筛选。药物筛选周期为1周,观察慢病毒携带荧光强度,选取存活的具备抵抗能力的细胞进行进一步的传代培养,将一部分细胞冻存,另一部分用于验证蛋白干预情况及功能探索等。4.共培养模型构建:培养人足细胞及HK-2密度达到80-90%进行消化处理。之后向六孔板及Transwell小室加入正糖培养基,将两种细胞按5 ×104分别均匀种至上述器皿,继续正常培养。6小时待细胞完全贴壁后,应用40 mM的高糖培养基孵育,将种有HK-2的Transwell小室中用镊子夹取放到种有人足细胞的六孔板中,向CO2培养箱中置于共培养体系,细胞正常培养48小时后进行观察与处理。5.Western blot:对空白组、病毒干预组及阴性对照组HK-2中Bim蛋白表达进行检测,验证慢病毒转染后干预效果;检测足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况,明确与不同PTECs共培养后对足细胞中骨架蛋白表达的影响。6.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光阳染及骨架微丝排列情况:（1）免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达:将不同处理组的足细胞行免疫荧光染色,应用免疫荧光显微镜检测足细胞爬片的荧光表达情况并采集图片。（2）罗丹明红标记鬼笔环肽染色细胞骨架排列情况检测:将不同处理组的足细胞行罗丹明红标记的鬼笔环肽染色,之后将爬片置于荧光显微镜下观察并采集图片。7.RT-PCR:对不同PTECs处理组中NFAT家族的不同亚型mRNA表达进行检测。8.免疫荧光检测不同PTECs处理组中NFAT2核转位情况。9.过表达质粒及小干扰RNA（siRNA）分别上调与下调PTECs中NFAT2表达,RT-PCR及Western blot检测干预效果:（1）向稳定下调Bim的HK-2细胞转染NFAT2质粒:将NFAT2质粒和LipofectamineTM 3000混合液转染至已稳定下调Bim的HK-2细胞中。（2）向 HK-2 细胞转染 NFAT2-siRNA:将 NFAT2-siRNA 和 LipofectamineTM 2000混合液转染至HK-2细胞中。（3）RT-PCR及Western blot:对经过不同处理的HK-2中的NFAT2 mRNA及蛋白表达水平进行检测。10.在调控PTECs中NFAT2表达后,再次构建共培养模型,Western blot检测不同处理组足细胞骨架蛋白表达情况;免疫荧光检测不同处理组足细胞骨架蛋白synaptopodin阳性表达及骨架微丝排列情况。11.小鼠饲养:将C57BL/6J雄性6-8周龄小鼠进行为期1周的适应性喂养,选取状态佳、体重相近的小鼠进行随机分组,分别为单侧肾脏切除组（UNX）、糖尿病肾病组（DN）及假手术组（Sham）进行后续处理与操作。12.小鼠DN模型构建:应用单侧肾切+小剂量链脲佐菌素（STZ）连续5天进行注射。13.体重、血糖、尿量、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮水平检测:为了对小鼠的体重及血糖值进行检测,分别于术前,STZ注射后3d,DM成模后第2,4,6,8,10,12周对小鼠尾尖进行采血。第二天通过代谢笼收集小鼠的全天尿液,全天小鼠饮食受限但不限制饮水,尿液收集结束后对小鼠尿量进行检测,并对小鼠尿蛋白水平应用考马斯亮蓝法进行检测;在第12周末,取小鼠心尖血,检测各组小鼠血肌酐、尿素氮水平。14.肾脏糖原染色（periodicacid-Schiff,PAS）:在试验第12周末处死小鼠,应用组织切片机将小鼠肾脏组织进行切割（厚度约3μm）,然后进行肾脏PAS染色,应用普通光学显微镜观察肾脏糖原沉积情况及病理学变化。15.免疫组化检测肾脏组织中Bim在各组小鼠中的定位及表达情况。16.Western blot检测肾脏组织中Bim及足细胞骨架蛋白synaptopodin蛋白表达水平。17.免疫荧光检测足细胞骨架蛋白synaptopodin在不同组小鼠中表达情况。18.统计学分析:所有样本重复3次以上进行统计学分析。所得数据均采用SPSS 22.0软件对其进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。P<0.05（双侧）被认为组间差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 5.0软件进绘制柱状图。研究结果1.40 mM高糖处理48 h显著诱导足细胞骨架蛋白synaptopodin表达下调及PTECs中Bim表达上调。（1）为了确定最佳高糖浓度及处理时间,对足细胞行不同高糖浓度及时间处理。Western blot结果显示:与正糖浓度5.5 mM相比,高糖浓度40 mM处理足细胞48小时显著诱导骨架蛋白synaptopodin表达减少（P<0.05）。（2）应用40 mM高糖处理PTECs,Western blot结果显示:与正糖5.5 mM组相比,40 mM高糖组PTECs中Bim蛋白表达明显增加（P<0.05）。2.Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功。（1）应用Enhance液稀释的病毒滴度MOI为20时转染下调Bim慢病毒的效率最高,荧光表达强度最强。（2）继续应用病毒滴度MOI为20的慢病毒感染PTECs,并应用1 μg/ml嘌呤霉素筛选1周,应用RT-PCR及Western blot验证干预效率,结果示:与转染阴性对照病毒组相比,转染干预Bim病毒组PTECs中Bim mRNA及蛋白表达均明显下调（P<0.05）,证实Bim下调PTECs稳定转染细胞株构建成功,留作后续使用。3.体外共培养模型成功构建:共培养模式图显示不同处理组,包括与对照PTECs高糖共培养足细胞组,与转染下调Bim慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组,与转染对照慢病毒的PTECs高糖共培养足细胞组。4.高糖诱导PTECs中Bim上调促使足细胞骨架损伤、排列紊乱,与下调Bim的PTECs共培养后足细胞骨架损伤得到明显缓解。（1）免疫荧光示:与PTECs在高糖下共培养48小时,足细胞骨架排列发生紊乱,但干预PTECs的Bim后再与足细胞共培养48小时,足细胞骨架排列重新恢复极性。（2）免疫荧光示:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调。（3）Western blot检测不同共培养处理组足细胞中synaptopodin蛋白表达结果与前述synaptopodin荧光染色结果一致:与对照PTECs在高糖下共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达明显下调,但与干预Bim的PTECs共培养48小时后,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达恢复上调（P<0.05）。5.进一步筛选PTECs中受Bim调控的诱导足细胞骨架损伤的下游分子,发现NFAT2表达及核转位受Bim调控。（1）应用RT-PCR筛选NFAT家族中受Bim调控的亚型,并用Western blot证实蛋白表达,研究结果示:PTECs中的NFAT2 mRNA及蛋白表达均受Bim调控。（2）由于NFAT家族是一类转录因子,主要通过发生核转位发挥基因调控功能。通过免疫荧光共聚焦显微镜检测在调控Bim后,PTECs中的NFAT2的核转位变化。结果示,在干预PTECs的Bim后,NFAT2核转位明显减少。6.RT-PCR及Western blot检测转染NFAT2-siRNA及过表达质粒分别下调与上调NFAT2后PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达变化。结果示,与转染阴性对照小干扰RNA相比,转染NFAT2-siRNA后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显下调（P<0.05）;与转染阴性对照质粒相比,转染NFAT2质粒后,PTECs中NFAT2 mRNA及蛋白表达明显上调（P<0.05）。7.高糖条件下PTECs中的Bim激活NFAT2介导足细胞骨架损伤。为了进一步明确PTECs中Bim调控NFAT2对足细胞骨架的影响,通过向PTECs转染干预NFAT2表达的siRNA,向稳定转染Lenti-Bim-shRNA的PTECs细胞株转染上调NFAT2表达的质粒,在此基础上与足细胞共培养,检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达及骨架微丝排列情况。（1）免疫荧光示:在干预PTECs中Bim的基础上重新上调NFAT2表达,足细胞微丝F-actin排列紊乱,骨架蛋白synaptopodin表达显著下调,提示高糖下PTECs中Bim上调NFAT2表达介导足细胞骨架损伤。（2）Western blot检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达,其结果与免疫荧光染色synaptopodin表达结果一致。8.小鼠外观、形态等基本情况:从实验开始到最终结束,UNX及Sham组小鼠精神可,状态佳,日常表现活跃,拥有光滑整齐且干净的体毛,对外界刺激能够做出快速且正确的反应。DN组小鼠待造模成功后总体状态偏差,日常表现萎靡不振,全身毛发暗黄枯燥,对外界事物无法做出及时且有效的反应。9.小鼠体重、血糖及尿量水平:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠体重增加减缓,部分小鼠体重甚至减轻;随机血糖明显升高,无自发血糖恢复;日常饮水量与尿量明显增加。10.小鼠尿蛋白、肾重/体重比值及血肌酐、尿素氮变化:与Sham及UNX组小鼠相比,DN组小鼠尿蛋白、肾重/体重比值、血肌酐及尿素氮水平明显增加。11.肾脏糖原染色:UNX及Sham组小鼠肾小球结构清晰,肾小管结构正常,排列整齐。DN组小鼠肾脏肥大,系膜细胞轻度增生,糖原沉积明显增多,出现肾小管排列紊乱,基底膜增厚等DN肾脏损伤病理变化。12免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏近端肾小管中Bim阳性染色明显增多,Bim在肾小球中无阳染。13.Western blot结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾脏组织中Bim蛋白表达明显上调（P<0.05）,肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin表达显著下调（P<0.05）。14.免疫荧光结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球足细胞骨架蛋白synaptopodin荧光表达显著下调。研究结论1.通过构建体外共培养模型,明确PTECs与足细胞之间存在管球交流作用。2.管球交流作用的机制初探为:高糖下,肾小管中表达上调的Bim通过激活下游NFAT2诱导足细胞骨架排列紊乱,即Bim/NFAT2介导管球交流在DN发生中具有潜在调节作用。3.DN小鼠肾小管Bim蛋白表达上调,足细胞骨架蛋白表达降低参与介导DN蛋白尿发生。研究背景DN的发生机制包括多种因素,遗传基因及信号转导通路中的蛋白分子常作为重要影响因素参与介导DN关键基因表型的表达。然而,不断增加的DN发生率表明,仍需要更深入地了解其潜在的分子机制,以确定更佳的治疗方法。越来越多的证据表明,与DN发生发展相关的基因不仅受到经典信号通路的调控,还受到组蛋白染色质修饰、DNA甲基化和非编码RNA等表观遗传机制的调控。通过全表观基因组关联研究来鉴定DN表观遗传发生机理也可能为精准医学研究提供信息,对及时诊断及治疗以防止其发展为终末期肾病具有重要价值。我们前期研究发现在DN病程中,肾小管病变早于肾小球,并通过构建体外近端肾小管上皮细胞（PTECs）-足细胞共培养模型,发现肾小管Bim上调致足细胞骨架紊乱参与DN发生发展,即早期的肾小管病变可通过Bim蛋白进一步诱导足细胞损伤。但是当前,针对小管小球间相互作用机制的研究刚刚起步,二者相互作用介导DN的确切机制仍有待探索。并且在实际临床工作中发现,因DN起病隐匿,很多患者在就诊时往往错过了干预早期肾小管病变的时机,病变已蔓延至肾小球,因此阻止肾小球病变的进展成为研究的重点。为寻找DN管球交流后诱导足细胞病变的“元凶”,此部分拟针对足细胞病变的始动机制展开研究。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）是一种非编码RNA,其转录之后的RNA长度超过200个核苷酸,但不能编码任何蛋白质,是研究较多的一种非编码RNA。近来研究表明,lncRNA在生长、发育、衰老、死亡等多种生物学过程中起重要作用。许多证据表明,lncRNA具有独特的基因调控作用,影响着基因转录、剪接、mRNA稳定性、表观遗传调控、细胞周期控制、分化和免疫应答等多种生物学机制和过程。lncRNA也可作为miRNAs的宿主RNA,并作为具有独立结构域的模块分子,使其能够与DNA、RNA和/或蛋白特异性结合,从而影响基因表达。因此,lncRNA常作为重要转录调控因子,参与多种疾病的起病及进展。许多lncRNA表达在人类疾病中被异常调节,lncRNA介导疾病发生发展的作用逐步被揭示。近年来研究表明lncRNA在介导DN发生中也发挥着重要作用。lncRNAPVT1参与纤维化和DN发病;另一项研究发现有21种lncRNAs在两种肾纤维化模型中表达上调,而在Smad3敲除小鼠模型中表达下调,提示这些lncRNA可能受到TGFβ/Smad3信号通路的调节,从而参与介导肾脏炎症及肾脏间质纤维化的发生。2016年的一项研究发现,lncRNAMGC是miR-379簇中近40个miRNA的宿主lncRNA,可以促进早期DN小鼠模型中系膜细胞外基质（ECM）的积累和肥大。另外有研究显示:过表达lncRNACYP4B1-PS1-001抑制DN系膜细胞增殖及纤维化。虽然目前已有较多阐述lncRNA在DN发生发展作用的机制研究,但是这些研究均仅从一个角度进行探索,对于细胞间交流介导DN发生的lncRNA的作用尚未有研究深入报道。为实现DN早期治疗,明确管球交流致足细胞早期病变的始动机制,我们将与不同肾小管细胞共培养的足细胞进行mRNA及lncRNA高通量芯片检测,得到在管球交流之后足细胞中lncRNA及靶基因变化数据,并进行相关机制研究,为进一步完善丰富管球交流致足细胞骨架紊乱机制提供阐释作用。研究目的我们前期研究已证实:肾小管上皮细胞的Bim蛋白能介导肾小球足细胞骨架损伤及其机制,为了能在管球交流的更早环节阻断对足细胞的损伤,我们进行了如下探索。研究方法1.Sino human lncRNA array V3.0 高通量芯片检测本研究利用Sino human lncRNA array V3.0高通量芯片进行检测。检测范围包括 lncRNA 与 mRNA。2.RT-PCR检测lncRNA表达验证lncRNA表达水平是否与芯片结果一致。3.调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染下调lncRNANONHSAT179542.1的小干扰RNA及阴性对照小干扰RNA;（2）RT-PCR检测调控足细胞中 lncRNA NONHSAT179542.1 后 lncRNA NONHSAT1 79542.1 mRNA 表达情况。4.调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR检测调控效果:（1）向足细胞转染上调MICAL2的过表达质粒及阴性对照质粒（MICAL2-NC）;（2）RT-PCR检测调控足细胞中MICAL2后MICAL2 mRNA表达。5.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架排列情况:（1）进一步构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架微丝排列情况。6.免疫荧光检测不同共培养组足细胞骨架蛋白荧光表达情况:（1）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。（2）构建体外共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白荧光表达情况。7.KEGG富集分析及cis/trans靶基因预测:（1）KEGG富集与细胞骨架相关通路;（2）应用cis/trans靶基因预测lncRNANONHSAT179542.1下游靶基因。8.Western blot检测不同共培养组足细胞中蛋白表达变化:（1）检测不同共培养组足细胞中骨架蛋白synaptopodin蛋白表达情况:1)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。2)构建共培养模型,在干预肾小管Bim表达的基础上,调控足细胞中MICAL2表达水平,观察足细胞骨架蛋白表达情况。（2）检测不同共培养组足细胞中MICAL2蛋白表达情况:1)构建共培养模型,分别检测在与对照PTECs共培养及与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞中MICAL2表达。2)构建共培养模型,分别检测在与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染下调lncRNA NONHSAT179542.1的siRNA,在下调PTECs中Bim的基础上向足细胞转染lncRNANONHSAT179542.1阴性对照小干扰后足细胞中MICAL2表达情况。3)构建共培养模型,分别检测与敲除Bim的PTECs共培养的足细胞,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2过表达质粒,与敲除Bim的PTECs共培养的基础上向足细胞转染MICAL2阴性对照质粒后足细胞中MICAL2表达情况。9.免疫组化检测不同组小鼠肾脏组织中MICAL2定位表达情况。10.统计学分析:对所有样本进行重复操作至少3次以上。应用统计学常用软件SPSS 22.0对所得数据进行统计学处理分析。统计学意义的评估:两组间比较采用T检验,数据均以mean±S.E.M.表示;应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对三组以上数据进行比较。组间差异统计学意义的设定为:P<0.05（双侧）。将所得数据输入GraphPad Prism 5.0软件中对柱状图进行绘制,予以直观展示。研究结果1.差异性lncRNAs筛选结果:（1）设置差异倍数（fold change,FC）1.5倍,P<0.05,将与对照PTECs高糖共培养的足细胞同与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到35个差异性表达的lncRNAs,其中17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,18个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。我们选取前十位差异表达倍数最大的差异性表达lncRNAs。（2）将与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞vs.与转染阴性对照慢病毒的PTECs高糖共培养的足细胞比较后,得到38个差异性表达的lncRNAs,其中21个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达上调,17个lncRNAs在与敲除Bim的PTECs高糖共培养的足细胞中表达下调。（3）由于与对照PTECs高糖共培养的足细胞与Lenti-Bim-shNC高糖共培养的足细胞二者产生的效应相似,故将二者分别同与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞比较,再取二者各自比较后的交集,共得到6个交集lncRNAs。将这6个交集lncRNAs同在与对照PTECs共培养vs.与Lenti-Bim-shRNA共培养比较后得到的前十个lncRNAs进行汇总,共得到14种lncRNAs进行后期验证处理。2.RT-PCR验证所挑选的14种lncRNAs表达水平是否与芯片检测结果一致:结果显示,lncRNANONHSAT179542.1,lncRNANONHSAT040129.2 及 lncRNA NONHSAT203700.1表达与芯片检测结果一致,三者均在与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞中表达上调,而其余11种lncRNA表达未见统计学差异。3.利用lncRNAs富集分析数据,我们选取29个与细胞骨架相关通路进行KEGG富集制图。联合lncRNA靶基因预测结果,选取与上述29个与细胞骨架相关通路相关的lncRNAs及靶基因进行制图,结果表明:lncRNA NONHSAT179542.1的26个靶基因所在通路与细胞骨架相关。结合RT-PCR验证结果,提示lncRNANONHSAT179542.1是介导共培养后足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。4.进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,明确其参与介导足细胞骨架损伤。（1）向与下调Bim的PTECs高糖共培养的足细胞转染干预lncRNA NONHSAT179542.1表达的siRNA及阴性对照小干扰siNC,RT-PCR检测干预效果。发现与阴性对照组相比,转染siRNA后成功下调足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1 表达（P<0.05）。（2）Western blot结果表明:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架蛋白表达显著减少（P<0.05）。（3）在成功干预足细胞lncRNANONHSAT179542.1表达后,进一步进行体外共培养,免疫荧光染色微丝F-actin发现:与Lenti-Bim-shRNA共培养组相比,Lenti-Bim-shRNA+转染干预 lncRNA NONHSAT179542.1-siRNA 共培养组足细胞骨架再次出现排列紊乱,极性消失甚至发生融合。（4）同样,免疫荧光染色足细胞骨架蛋白synaptopodin得到与Western blot一致的结果。5.靶基因预测及功能验证示MICAL2为lncRNA NONHSAT179542.1潜在下游靶基因。（1）lncRNA NONHSAT179542.1 的 cis/trans 靶基因预测:将lncRNA NONHSAT179542.1进行cis/trans靶基因预测后绘制网络图,预测该lncRNA共有218个潜在下游靶基因。（2）结合mRNA芯片数据结果,发现218个靶基因中仅MICAL2在对照PTECs共培养足细胞与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中差异性表达。进一步应用Western blot验证发现与对照PTECs共培养足细胞相比,MICAL2在与Lenti-Bim-shRNA共培养足细胞中表达显著降低（P<0.05）,与芯片结果趋势一致。（3）进一步调控足细胞中lncRNANONHSAT179542.1后检测MICAL2表达,Western blot结果表明干预肾小管中Bim表达,足细胞中lncRNA NONHSAT179542.1表达上调,MICAL2表达显著减少（P<0.05）;而在下调肾小管中Bim表达的基础上,继续下调足细胞中lncRNANONHSAT179542.1表达,MICAL2表达则恢复上调（P<0.05）。6.体外进一步调控足细胞中MICAL2表达,RT-PCR及Western blot检测调控效果。向与Lenti-Bim-shRNA高糖共培养的足细胞转染上调MICAL2表达质粒及阴性对照质粒,RT-PCR及Western blot检测调控效果。结果显示:与阴性对照质粒组相比,转染MICAL2过表达质粒后成功上调足细胞中MICAL2 mRNA与蛋白表达（P<0.05）。7.体外再次构建共培养模型,免疫荧光染色验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架损伤。（1）免疫荧光染色骨架微丝排列结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架微丝排列紊乱。（2）免疫荧光染色骨架蛋白表达结果显示:在干预肾小管Bim后上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达显著下调,提示足细胞MICAL2参与介导肾小管Bim诱导的足细胞骨架功能障碍。8.Western blot验证MICAL2参与肾小管Bim介导的足细胞骨架蛋白表达异常。Western blot结果与免疫荧光染色骨架蛋白结果一致。表明:在与Lenti-Bim-shRNA共培养的基础上继续上调足细胞MICAL2表达,足细胞骨架蛋白表达再次减少（P<0.05）。9.免疫组化结果显示:与UNX及Sham组小鼠相比,DN组小鼠肾小球中MICAL2阳性染色显著增多。UNX与Sham组小鼠肾脏中MICAL2阳性染色情况无显著差异。研究结论1.LncRNANONHSAT179542.1是参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤的关键性 lncRNA。2.LncRNA NONHSAT179542.1通过调控下游因子MICAL2参与肾小管Bim诱导的足细胞骨架损伤作用。3.本研究从表观遗传学角度揭示管球交流介导早期足细胞骨架损伤作用,深入阐明了“管球交流”来源的lncRNANONHSAT179542.1介导早期足细胞损伤的致病机理,为从效应蛋白MICAL2入手抑制足细胞损伤的治疗奠定基础,为明确DN发生机制提供新视角与新发现。