朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种危害多种经济作物的重要农业害螨。随着化学农药的大量、不科学使用以及害螨自身的特点,朱砂叶螨的抗药性问题日益加剧,对目前市场上的大部分杀螨剂都产生了一定程度的抗药性,从而给农业生产带来了巨大的损失。甲氰菊酯是一种常用的具有杀虫、杀螨活性的拟除虫菊酯类农药。研究表明朱砂叶螨、二斑叶螨以及柑橘全爪螨等都已经对其产生了较高水平的抗药性。细胞色素P450酶系是昆虫(螨)体内一类关键解毒酶系,可以代谢多种内、外源化合物,在昆虫(螨)对杀虫(螨)剂的解毒代谢过程中起着十分重要的作用。目前,对于细胞色素P450介导朱砂叶螨甲氰菊酯抗性机制的报道相对较少,且多集中在生化水平层面。因此,对细胞色素P450酶系进行整体研究,并从转录水平上认识P450基因表达的调控机制,对于进一步明确其介导的代谢抗性机理,全面揭示朱砂叶螨代谢抗性机制具有重要意义,在实践上对于制定朱砂叶螨抗药性的治理策略亦具有非常重要的指导意义。本学位论文的主要研究结果总结如下:1.甲氰菊酯对朱砂叶螨敏感和甲氰菊酯抗性品系的毒力测定采用药膜法测定出甲氰菊酯对朱砂叶螨敏感品系(SS)和甲氰菊酯抗性品系(FeR)的致死中浓度分别为606.98 mg/L和61581.93 mg/L,表明目前室内筛选的抗性品系对甲氰菊酯的抗性已达101倍的高抗水平。经P450酶系特异性抑制剂PBO处理后,抗性倍数下降至75倍,也就是说PBO抑制了26倍的甲氰菊酯抗性,这初步说明P450酶系在朱砂叶螨甲氰菊酯的抗性形成中具有重要作用。2.朱砂叶螨与甲氰菊酯抗性相关的P450及其功能相关基因的筛选、克隆及序列分析从本课题组之前的表达谱测序以及基因芯片数据中获得了6条在甲氰菊酯抗性品系中过表达的P450 Unigenes片段。通过qPCR验证表明6条P450基因在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系中的表达量都显著高于敏感品系,与表达谱测序和基因芯片数据结果一致,其上调倍数为1.96-5.92倍。对细胞色素P450还原酶基因进行qPCR分析,发现其在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系中上调表达4.12倍。这些结果初步表明6条过表达的P450基因和1条细胞色素P450还原酶基因都与朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗性产生有关。基于朱砂叶螨转录组数据和二斑叶螨基因组数据,通过RT-PCR技术,成功克隆出朱砂叶螨6条P450基因和1条P450还原酶基因c DNA全长序列,其中6条P450基因命名以及Gene Bank登录号分别为CYP384A1(KT851973)、CYP389B1(KF770839)、CYP391A1(KT851972)、CYP392A26(KF770838)、CYP392A28(KT851975)和CYP392D11(KT851974)。这6条P450基因的开放阅读框长度范围为1488 bp-1671 bp,预测蛋白分子量大小在56.79 k Da-64.03 k Da之间。将朱砂叶螨P450还原酶基因命名为TcCPR,Gen Bank登录号为KP710970。TcCPR基因完整开放阅读框包含2004个碱基,编码667个氨基酸残基,其预测蛋白分子量大小为75.47 k Da。生物信息学分析结果表明6条P450基因均为微粒体型P450,均包含一系列P450特征区域,例如螺旋C区、螺旋I区、螺旋K区、meander区域和血红素结合区。系统发育分析发现CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11属于Clan 2,CYP384A1属于Clan 3,而CYP389B1和CYP391A1属于Clan 4。同样对TcCPR生物信息学特性分析发现其存在跨膜结构域和信号肽,氨基酸序列含有FMN、FAD及NADPH保守功能区域,与二斑叶螨Tu CPR基因的亲缘关系最近,而与昆虫纲CPR基因的亲缘关系稍远。3.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因的表达模式解析通过qPCR对朱砂叶螨6条P450基因在不同发育阶段的m RNA水平进行检测,结果表明不同的P450基因在不同发育阶段的表达具有特异性。药剂胁迫诱导实验发现被甲氰菊酯胁迫6 h、12 h和24 h后,P450基因的表达量在敏感品系中总体变化差异不大,但是在甲氰菊酯抗性品系中都能被显著诱导上调表达,且表达水平变化具有一定的时间效应。这些结果表明朱砂叶螨6条P450基因与甲氰菊酯抗性形成有关,且在抗性品系中对甲氰菊酯的胁迫诱导更加敏感。TcCPR基因在朱砂叶螨不同发育阶段的表达模式与多数朱砂叶螨P450基因具有较高的一致性,在幼螨、若螨和成螨中表达量较高,而在卵中最低,在三种螨态的表达量分别是卵期的5.40倍、4.47倍和4.75倍,反映出TcCPR与P450间的协同一致性。经甲氰菊酯诱导6 h、12h和24 h后TcCPR基因的表达水平升高,但敏感品系中差异不大(低于1.5倍),而在甲氰菊酯抗性品系中差异显著,其表达量分别是对照的3.70倍、3.95倍和4.61倍,再次表明P450酶系,包括TcCPR基因,在抗性品系中对甲氰菊酯的胁迫诱导反应更强烈。4.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因RNAi研究采用基于“叶碟饲喂法”的RNAi技术对朱砂叶螨在FeR中过表达的6条P450基因进行研究,结果发现饲喂单条P450基因ds RNA(1000 ng/μL)后,CYP384A1、CYP389B1、CYP391A1、CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11的沉默效率达到55.27%-74.19%,朱砂叶螨P450s酶活性显著降低1.21-2.29倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加8.39%-15.78%和7.88%-17.49%。当同时饲喂6条P450基因ds RNA混合物后,6条P450基因沉默效率为35.93%-65.64%,朱砂叶螨P450s酶活性显著降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加30.73%和33.17%。六条P450基因的RNAi实验表明6条P450基因都不同程度地参与了朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗药性形成,且6条基因存在明显的协同增效现象。同样,对TcCPR基因实施RNAi后,其在朱砂叶螨SS和FeR中的沉默效率分别达到52.5%和41.0%,FeR中的P450s酶活性显著降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加21.60%和26.20%,但SS对甲氰菊酯的敏感性并没有显著的变化。此外,抑制TcCPR基因的表达后,6条P450基因m RNA的表达水平并没有明显改变。这些结果表明,一方面TcCPR基因可影响P450s酶活性,另一方面朱砂叶螨FeR中P450/CPR对甲氰菊酯胁迫更敏感,在朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗性形成中发挥了重要作用。5.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因原核表达研究借助大肠杆菌表达系统对朱砂叶螨6条P450基因和1条CPR基因进行原核表达,以期获得体外重组蛋白并进行功能研究。最终6条P450基因和1条CPR基因都成功得到表达,但其中只有CYP384A1、CYP389B1、CYP392A28、CYP392D11和TcCPR基因获得了可溶性重组蛋白,并且只有CYP384A1、CYP389B1和TcCPR基因的表达产物可检测到蛋白活性。重组蛋白TcCPR活性为512.69±139.21 nmol/mg pro.min-1(细胞色素C为底物),CYP384A1和CYP389B1的脱甲基活性分别为3.74±0.29 nmol/mg pro.min-1和0.97±0.11 nmol/mg pro.min-1(对硝基苯甲醚为底物)。CYP384A1和CYP389B1都能够结合并分解甲氰菊酯:甲氰菊酯对CYP384A1的抑制中浓度为181.3±18.8μM,10μg和20μg的CYP384A1对甲氰菊酯的分解率分别为30.83±3.87%和40.75±3.50%;甲氰菊酯对CYP389B1的抑制中浓度为259.3±116.1μM,10μg和20μg的CYP389B1对甲氰菊酯的分解率分别为22.57±6.88%和30.62±3.16%。基因原核表达及功能验证实验表明,P450/CPR可直接分解甲氰菊酯,从而介导朱砂叶螨对甲氰菊酯产生抗药性。6.朱砂叶螨转录因子对甲氰菊酯抗性相关P450基因的调控研究克隆获得了朱砂叶螨的6条感受异源物质胁迫的转录因子c DNA全长,分别命名为CncC、Maf、HNF4、HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)。qPCR检测发现CncC、Maf和HNF4在FeR中表达量都显著高于SS,其上调倍数分别为394.83倍、3.03倍和4413.57倍,而HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)的m RNA表达量在SS和FeR中没有显著差异。通过RNAi沉默转录因子CncC后,CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的m RNA表达量显著下调,P450s酶活性显著降低,甲氰菊酯胁迫后的死亡率显著提高了12.75%-20.40%;沉默转录因子Maf后,CYP389B1和CYP392A28的m RNA表达量显著下调,P450s酶活性显著降低,甲氰菊酯胁迫后的死亡率显著提高了19.50%-21.10%;HNF4被沉默后,P450基因表达、P450s活性以及对甲氰菊酯的敏感性都没有显著变化。转录因子RNAi研究结果表明CncC和Maf可以调控CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的表达,从而导致朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性发生改变。进一步通过荧光素酶报告系统对转录因子CncC和Maf与P450基因启动子的结合及调控关系进行分析,发现CncC和Maf都能影响CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的启动子的荧光活性:其中CYP389B1和CYP392A28的启动子同时结合CncC和Maf后的荧光活性要显著大于单独结合CncC的活性,而CYP391A1的启动子单独结合CncC后的荧光活性要显著大于同时结合CncC和Maf的活性,但是三条P450基因的启动子单独结合Maf后的荧光活性与对照没有显著差异。荧光素酶结合实验不但确证了RNAi实验结果(即CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28确实受到CncC和Maf的调控),而且进一步明确了转录因子和P450基因的调控关系:CncC和CncC-Maf都能调控CYP389B1和CYP392A28的表达,CYP391A1的表达主要受CncC的调控,而Maf不能单独调控P450基因的表达。