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研究背景原发性肝癌是我国恶性肿瘤死亡的主要原因之一,虽然近年来多种先进治疗手段的发展明显改善了其临床治疗效果,但原发性肝癌患者的5年生存率仍然低于50%,不仅手术后易复发,而且大部分患者在就诊时已经丧失了手术治疗时机。肝癌患者对于化疗药物的耐药是导致治疗失败、影响原发性肝癌治愈率和远期生存率的主要原因。因此,探讨肝癌耐药机制并且寻找有效的方法逆转肝癌耐药具有十分重要的意义。转录因子FoxO1是近年来的研究热点,FoxO1属于Fox家族,Fox蛋白家族因其具有同源的保守Fox结构域而得名。FoxO1作为FoxO亚家族中的被一个发现的成员,在机体的发育、分化、代谢等过程中起重要调控作用,参与细胞代谢调节、细胞周期及凋亡的调节、以及肿瘤的发生/抑制等,近年来其与肿瘤化疗耐药的关系越来越为人们所重视。肿瘤对化疗药物的耐药性是肿瘤治疗过程中最为棘手的问题,包括原药耐药（primary drug resistance,PDR）和多药耐药（multi-drug resistance,MDR）,其中以MDR是多种肿瘤化疗失败的主要的原因。MDR的发生机制复杂,是多因素综合作用的结果。这涉及到细胞信号转导、细胞损伤修复能力的改变、多耐药相关蛋白异常表达等各个方面,特别是细胞内药物能否达到治疗所需要的靶向浓度是决定肿瘤细胞暴露于化疗药物是生存还是死亡的最关键点。多种膜转运蛋白可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物排出,使细胞内药物浓度降低,从而使细胞产生耐药,目前这是被认为最重要的一类耐药机制。多耐药蛋白1（multi-drug resistance1,MDR1）是最重要的一种膜转运蛋白,与多种肿瘤耐药密切相关。Han的研究表明,在MDR1近侧启动子区域有一个Fox O结合位点,与增强子/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding proteinβ,C/EBPβ）结合区域部分重叠。在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤的耐药细胞中,FoxO 1与MDR1的DNA结合活性选择性增高,FoxO1的过度表达可以导致MDR1的表达增高,同时FoxO1的沉默也抑制MDR1的表达。同时有研究表明FoxO1还可以通过介导细胞周期的停滞和DNA修复能力的增强诱导肿瘤细胞耐药性增强,可见转录因子FoxO1与肿瘤耐药有关。目的本实验使用5-氟脲嘧啶（5-fu）诱导肝癌HepG2细胞耐药,观察非耐药HepG2细胞、具有耐药性的HepG2细胞以及通过siRNA沉默FoxO1的耐药HepG2细胞中FoxO1的表达情况变化及各组细胞中MDR1表达的变化,探讨FoxO1与MDR1基因表达的联系及其对HepG2细胞耐药情况的影响。实验方法1.FoxO1特异性的siRNA载体的构建和质粒的抽提纯化。由TaKaRa公司合成针对FoxO1的特异性siRNA载体（pSIREN-DNR-DsRed-siFoxO1）,并进行测序鉴定;对质粒进行抽提纯化。2.肝癌HepG2细胞,置于37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱中无菌培养,对数生长时,0.05%的胰蛋白酶加0.02%的EDTA消化传代。培养24h后用含5μg/ml 5-fu的培养基作用细胞24h,改用正常培养基,待细胞恢复增殖活性（约2周）,存活细胞进入对数生长期后消化传代。细胞生长状态良好后根据存活细胞增殖情况逐次提高药物浓度,采用递增浓度5-fu周期作用方式反复冲击诱导处理HepG2细胞,历时3个月,诱导HepG2细胞耐药性,称作HepG2/5-fu细胞。3.培养过程中显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测HepG2/5-fu细胞对5-fu、顺铂（DDP）和阿霉素（AMD）的耐药指数。4.采用脂质体转染荧光标记FoxO1质粒沉默HepG2/5-fu细胞FoxO1;采用RT-PCR技术检测FoxO1的沉默情况,检测各组细胞中FoxO1和MDR1的基因表达。5.采用MTT法检测抗肿瘤药物对HepG2细胞、HepG2/5-fu细胞、siRNA FoxO1的HepG2/5-fu细胞的杀伤作用,对比其对抗癌药物5-fu的敏感性变化。采用统计学软件包SPSS12.0对结果进行统计分析,将所得计量数据以平均数±标准差（（?）±s）表示,确定方差齐性后,进行t检验或方差分析,P＜0.05为显著性差异。结果1.HepG2细胞耐药性的诱导:加药5μg/ml的冲击数小时内,细胞无明显变化;10 h后可见细胞稍微变圆;24 h后换正常培养基,细胞继续死亡,此后细胞死亡的数目逐渐增多,且其死亡高峰位于脱药后的48～72h之间。脱药7天左右,原本将近铺满瓶底（70%～80%）的细胞仅有10%剩余,细胞缓慢恢复增殖能力,生长1W后细胞逐渐生长形成菊团状,传代生长,后加10μg/ml的含5-fu的培养基孵育24h后换正常培养基,细胞持续死亡最终仅剩10%左右,逐次加量,3个月后获得的细胞称为HepG2/5-fu细胞。2.耐药细胞形态和生物学特性的改变:倒置显微镜下观察细胞形态,正常HepG2细胞在不同浓度5-fu的作用之下,经过一段时间可见肿瘤细胞与正常细胞相比细胞胞体增大、细胞拉长、贴壁牢固。传代时发现细胞之间融合生长,群体倍增时间延长。对5-fu的耐药指数为7.42,具有显著性差异（P＜0.01）,对DDP也有交叉耐药性（P＜0.05）。3.荧光质粒转染沉默FoxO1结果:进行脂质体转染24h后荧光显微镜下观察转染质粒后的细胞发出红色荧光,荧光强度持续72h后逐渐减弱。采用RT-PCR检测转染抑制率约为42%。4.RT-PCR检测各组FoxO1和MDR1的表达结果:正常HepG2细胞中有FoxO1和MDR1的表达,而耐药HepG2细胞中FoxO1和MDR1的表达明显强于正常对照组,质粒转染后FoxO1的表达下降,同时MDR1的表达明显弱于耐药细胞组。5.检测HepG2细胞、HepG2/5-fu细胞以及沉默FoxO1后的HepG2/5-fu细胞耐药性变化:MTT检测正常HepG2细胞耐药性明显低于HepG2/5-fu细胞;沉默foxO1后,HepG2/5-fu细胞的耐药性趋向降低。结论:1.在抗肿瘤药物5-fu的作用下FoxO1在耐药肝癌细胞中的表达量上调;2.FoxO1siRNA可降低HepG2/5-fu细胞的耐药性;3.MDR1和FoxO1的表达具有相关性可能是FoxO1与肝癌细胞耐药相关的原因之一。