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背景与目的肺癌在世界范围内是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,严重危害着人们的生命健康安全。大量的研究发现肺癌细胞在机体内可通过多种途径拮抗机体对于细胞增殖和凋亡的调控作用,造成肺癌细胞在机体组织内的恶性增殖从而对机体内正常的组织细胞功能产生损害。近来有研究证实肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)可引起肿瘤细胞的凋亡,且其作为由免疫细胞分泌的具有多种复杂生物活性的细胞因子,可介导包括增殖、分化、炎症和细胞凋亡在内的多种细胞反应,具有广泛的抗肿瘤作用。而核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κ]B)是TNF-α诱导炎症反应的信号转导核心,能与多种增强子以及启动子结合,抑制NF-κB的活性理论上可以阻断TNF-α启动的炎症反应、细胞凋亡以及氧化应激的水平变化。热休克蛋白-70(heat shock protein-70,HSP70)是热休克蛋白家族(Heat shock proteins,HSPs)中的重要一员可作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、组装和降解等生物学过程,有研究发现HSP70在肺癌组织中的过表达与肺癌患者的不良预后有联系,高表达的HSP70往往对肿瘤细胞的生存有利。在课题组的前期实验中,TNF-α诱导A549细胞凋亡的过程中伴随着非吞噬细胞氧化酶-1(Non-phagocytic cell oxidase-1,NOX1)表达的上升以及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的积累,NOX1作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶家族的重要一员,其产生的ROS对维持机体内的氧化还原平衡至关重要。因此本研究的目的是探索HSP70对TNF-α诱导的A549细胞凋亡过程是否有影响以及其中可能的作用机制,同时验证NOX1蛋白、NF-κB信号蛋白在TNF-α诱导的A549细胞凋亡过程中的作用,探讨HSP70、NOX1以及NF-κB三者之间是否存在联系?从而为验证HSP70蛋白作为肺癌诊断、治疗方面的潜在靶点提供相应的理论依据和实验基础。方法1、实验分组:(1)A549细胞凋亡模型的构建:根据TNF-α的不同浓度可分为:0.00nmol/L 组,0.25nmol/L组,0.50nmol/L 组,1.00nmol/L组;(2)抑制 HSP70 的表达时分组为:空白组,TNF-α组,VER155008(HSP70 抑制剂)组,TNF-α+VER155008组;(3)抑制NF-κB的表达时分组为:空白组,TNF-α组,BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组,TNF-α+BAY11-7082 组。2、观察细胞形态:使用活细胞工作站对各分组细胞进行拍照,观察各组间细胞形态的变化情况。3、细胞增殖活性的检测:CCK-8检测试剂盒结合酶标仪的使用检测各分组细胞的增殖活性,根据各组细胞吸光度的大小判断细胞的增殖活性。4、蛋白表达的检测:采用Western Blot实验检测细胞中HSP70、NOX1以及NF-κB蛋白表达的变化情况。5、细胞凋亡的检测:Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪的使用检测各分组细胞的凋亡情况。6、统计学分析:实验所取得的原始数据均采用均数±标准差的形式来表示(x±s,n=3),所得数据采用SPSS21.0统计学软件进行分析,多组间的均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVE),各组之间均数的两两比较采用LSD-t检验(最小显著差异法);只有两组的分组均数则采用两独立样本t检验,设检测水准α=0.05。结果1、当TNF-α的浓度为0.50nmol/L时,TNF-α刺激A549细胞24h可以显著降低细胞的增殖活性并促进细胞的凋亡,同时伴随着NOX1蛋白、NF-κB信号蛋白表达的上升(均P<0.05),但对HSP70蛋白的表达无影响(P>0.05);因此,本次研究选择0.50nmol/L浓度的TNF-α进行后续实验。2、TNF-α+VER155008 组与 TNF-α 组相比,HSP70、NOX1 蛋白以及 NF-κB 信号蛋白的表达明显下降(均P<0.05);VER155008组与空白组相比,HSP70、NOX1蛋白以及NF-κB信号蛋白的表达均下降(均P<0.05);CCK-8实验的结果显示:TNF-α+VER155008组与TNF-α组相比,细胞的增殖活性进一步降低(P<0.05);流式细胞仪的结果显示:TNF-α+VER155008组与TNF-α组相比,细胞的凋亡率进一步升高(P<0.05)。说明抑制HSP70的表达可促进TNF-α诱导的A549细胞的凋亡。3、TNF-α+BAY1 1-7082组与TNF-α组相比,NOX1蛋白、NF-κB信号蛋白的表达明显下降(均P<0.05),HSP70蛋白的表达无明显变化(P>0.05);BAY11-7082组与空白组相比,NOX1蛋白、NF-κB信号蛋白的表达均下降(均P<0.05);CCK-8实验的结果显示:TNF-α+BAY1 1-7082组与TNF-α组相比,细胞的增殖活性升高(P<0.05);流式细胞仪的结果显示:TNF-α+BAY 11-7082组与TNF-α组相比,细胞的凋亡率下降(P<0.05)。说明NOX1、NF-κB在TNF-α诱导A549细胞的凋亡过程中发挥重要作用。结论本次研究的结果表明,NOX1、NF-κB蛋白可介导由TNF-α诱导的A549细胞的凋亡;降低HSP70在A549细胞中的表达水平能够通过NF-κB/NOX1信号通路促进TNF-α诱导的细胞凋亡,提示HSP70可作为肺癌治疗的潜在靶点。