类胡萝卜素是植物体内重要的次生代谢产物,它不仅能为植物提供五彩斑斓的颜色,同时还能参与光合作用和激素合成等重要的生物学过程。β-胡萝卜素作为一种主要的类胡萝卜素,是人体维生素A的重要来源。此外,它做为人体必要的健康保护物能降低某些癌症和心血管疾病的发病率。因此,研究植物β-胡萝卜素的代谢调控具有十分重要的作用。柑橘由于富含类胡萝卜素而成为研究类胡萝卜素代谢调控的良好材料。本实验利用β-胡萝卜素含量差异显著亲本的杂交群体构建了高密度遗传图谱,同时我们还利用柚β-胡萝卜素突变体材料和超量表达柑橘LCYb基因后大量积累p-胡萝卜素的番茄材料对p-胡萝卜素的代谢与调控进行了研究,主要结果如下：1.柑橘杂交群体的创建及高密度分子遗传图谱的构建1)利用高β-胡萝卜素含量材料(黄肉琯溪蜜柚)作为母本,低β-胡萝卜素含量材料(坪山柚)作为父本,构建其F1代遗传分离群体,总共得到了550株杂交后代。2)利用RAD-seq技术对亲本及其124个杂种后代进行了测序,根据亲本SNP位点信息对子代得到的SNP分型进行统计。进而通过测序深度、孟德尔遗传的卡方检验及缺失率对这些SNP位点进行过滤,最终得到了1,543个可用于构建遗传图谱的可靠SNP位点。3)为便于图谱间的整合及比较,我们从前人柚遗传图谱中筛选到了20个可用于本遗传图谱构建的SSR引物。用筛选出来的多态性引物对本实验中的双亲及F1代遗传群体(124个单株)进行扩增,对其分离情况进行统计。4)根据拟测交作图原理,利用Joinmap4.0软件对获得的1,563个标记进行连锁分析,并构建柚遗传连锁图谱。这些标记位点被定位在9条连锁群上,总遗传图距为976.58 cM,标记间平均距离为0.62 cM。大部分标记在连锁群上均匀分布,9个连锁群上的标记数目为81-285个,连锁群长度为75.42-139.26 cM。5)利用这些标记在遗传图谱及甜橙基因组的位置信息进行共线性分析,结果显示：大部分的标记在二者间具有良好的共线性,这不仅说明本实验所构建图谱质量的可靠性,也从一程度上证实了柚与甜橙极高的相似度。6)将本研究构建的图谱和其他研究者构建的包含有20个共同SSR标记位点的2张柚图谱进行比较分析。发现这些标记不仅分群及相对位置一致,同时遗传距离也极为接近,这更进一步证明了本实验所构建的遗传图谱质量可靠。这些共有的SSR标记使得我们未来能够进行图谱的整合,使本研究构建的图谱具有更加重要的应用价值。2.琯溪蜜柚果皮橙色突变体性状形成机理的初探1)利用HPLC测定了成熟期琯溪蜜柚有色层橙色突变体果皮中类胡萝卜素的组成与含量变化。结果表明：突变体果皮中呈橙色是β-胡萝卜素的大量累积所致,其β-胡萝卜素的含量比野生型增加了10.5倍,并且总类胡萝卜素的含量也增加了7.9倍。2)利用qRT-PCR测定了突变体(MT)及其野生型(WT)中类胡萝卜素代谢途径关键酶基因的表达。结果表明：MT中上游基因PSY,PDS和CCS及下游基因CCD1、BCH和NCED2的表达量都显著低于野生型。3)RNA-seq分析结果显示：与WT相比共有303个基因在MT果皮中存在显著差异表达(padj<0.05),其中135个基因上调表达,而168个基因下调表达。Pathway分析显示,MT果皮中碳代谢、氨基酸的生物合成和淀粉与蔗糖代谢发生了显著变化。4)GC-MS测定结果显示：大多数可溶性糖和氨基酸的含量都发生了显著变化。其中,MT大多数可溶性糖的含量都显著降低,但却大量积累了WT中几乎检测不到的天冬酰胺。综合分析我们认为,MT果皮中β-胡萝卜素及总类胡萝卜素的增加,一方面是由于类胡萝卜素代谢下游基因下调表达,另一方面是由于糖酵解加速产生的前体物质增加而引起的。而上游合成基因的下调表达很有可能是由于类胡萝卜素积累后的反馈调节作用所引起的。5)为了寻找参与p-胡萝卜素代谢调控的关键基因,我们对另外一对β-胡萝卜素突变体材料(果肉橙色突变体)也进行了RNA-seq分析,共鉴定到了200个基因差异表达,其中92个基因上调表达,108个基因下调表达。对这两对突变体材料的转录组数据综合分析后,我们找到了10个共同差异基因,这些基因主要参与脂肪酸代谢和抗性反应。3.转CsLCYb基因调控类胡萝卜素代谢的研究1)利用实验室前期创制的类胡萝卜素转基因番茄材料,通过PCR筛选得到单拷贝纯系植株T217-1用于后续研究。筛选得到的T2代CsLCYb转基因番茄果实仍然呈现与T0代相似的黄色表型,说明该转基因事件十分稳定。2)选取CsLCYb转基因番茄三个发育时期(绿熟期、破色期和成熟期)的果实及其野生型对照作为研究材料。HPLC分析结果表明：三个时期转基因番茄果实中β-胡萝卜素及总类胡萝卜素的含量都显著增加,而α-支路的总类胡萝卜素含量都明显减少；成熟期转基因果实中α-胡萝卜素的含量显著增加,同时还检测到了野生型中没有生成的紫黄质。对三个时期CsLCYb转基因番茄果实质体发育及形态的研究发现,其与野生型之间不存在明显差异。3)利用qRT-PCR测定转基因及野生型番茄果实三个时期类胡萝卜素代谢途径关键基因的表达。结果表明：在绿熟期,转基因果实除了PDS和LCYe呈现上调表达外,其它基因均呈现下调表达；在转色期,转基因果实上游所有基因均表现上调表达,而下游基因LCYE、BCH和ZEP则呈现下调表达；在成熟期,转基因番茄中除ZEP外的其它类胡萝卜素合成基因均上调表达。三个时期转基因果实中ZEP基因的表达都显著低于野生型。4)芯片分析结果显示,与对照相比共有93个基因在CsLCYb超量表达番茄果实中显著差异表达(FDR≤0.05,差异倍数≥2),其中30个基因上调表达,63个基因下调表达。GO分析发现这些差异基因的生物学功能主要以结合、催化活性、水解酶活性和蛋白结合为主。进一步利用KEGG对这些差异基因所参与的代谢途径分析后发现,次生代谢的合成和降解、脂类代谢、淀粉和蔗糖代谢以及光呼吸等代谢途径在CsLCYb超量表达的番茄果实中发生显著变化。5)根据类胡萝卜素合成基因表达数据,我们利用LC-MS对三个时期番茄果实的ABA含量进行了测定,结果表明CsLCYb番茄果实中的ABA含量在三个时期都显著低于野生型,这与基因表达数据十分吻合。根据芯片数据,我们利用GC对三个发育时期番茄果实中可溶性糖的含量进行了测定,结果表明：三个时期野生型与转基因之间的蔗糖含量没有明显差异,而果糖和葡萄糖含量变化表现出一致的趋势。转基因果实中三个时期果糖和葡萄糖的含量均低于野生型,特别是成熟期的差异达到了极显著水平。