节瓜再生体系的优化及遗传转化体系的建立

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节瓜(Benincasa hispida Cogn.var.chieh-qua How)是我国特产蔬菜之一,也是华南地区的主要蔬菜作物。由于遗传背景比较狭窄,不利于育种工作特别是抗病育种工作的深入进行。鉴于基因工程技术在种质资源创新方面的作用,探索节瓜高效转基因技术非常必要。本论文以节瓜优良自交系为材料,优化了节瓜离体培养体系,并利用含OsOxO1-PBI121质粒的工程农杆菌EHA105转化,初步建立了节瓜遗传转化方法。主要结果如下:  1、以节瓜优良自交系为材料,优化了再生体系。实验中探究不同的节瓜基因型,不同外植体类型,不同激素配比对外植体分化率的影响。实验结果表明,以节瓜A39品种为材料,选取子叶节为外植体,在MS+6mg/L6-BA+0.2mg/LNAA诱导分化培养基中培养21d,分化情况最佳,分化率达到77.1%。  2、在优化节瓜再生体系的基础上,以子叶和子叶节为外植体进行农杆菌介导法转化。研究发现,子叶在添加卡那霉素的筛选培养基上无法分化不定芽,而子叶节在筛选培养基上可以分化不定芽。确定了卡那霉素最佳筛选浓度,抑菌抗生素头孢霉素的抑菌浓度分别为55mg/L、500mg/L;同时探究了卡那霉素、头孢霉素对节瓜组培苗不定根发育的影响。在农杆菌介导法转化过程中,采用了1344个子叶节外植体,最终获得17株Kan抗性植株。  3、初步建立了农杆菌介导的Floral-dip法进行节瓜遗传转化的实验体系,并获得转基因植株。比较了不同雌花发育阶段农杆菌处理对节瓜坐果率的影响,发现选取开花前1d,开花前3d,授粉后5h的雌花转化,坐果率分别为11.5%,7.14%,41.2%:选取开花前2d,开花前4~6d的雌花转化,坐果率为O;探究不同浓度的卡那霉素对节瓜种子发芽和幼苗生长状况,研究发现卡那霉素浓度达到350.mg/L以上时主根缩短且不发生侧根,叶片严重黄化,确定卡那霉素的筛选浓度为350mg/L。通过floral-dip法收获节瓜果实21个,种子9277粒,经卡那霉素筛选得到114株抗性幼苗,移栽成活52株。对移栽成活的52株抗性植株进行PCR检测,结果表明,在500bp位置有特异条带出现,初步说明NPTⅡ基因已整合到植物基因组中。对全部52株抗性植株检测结果表明,有13株植株经PCR检测呈阳性,全部为开花前1d进行子房涂抹处理产生的种子。
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