玉米是全世界第一大作物,是重要的粮食、饲料和工业原料。在各种作物淀粉中,玉米淀粉具有最佳的化学组成,全球淀粉产量的80%左右为玉米淀粉。淀粉产量和淀粉组成结构是影响淀粉业发展的两大因素。在普通玉米籽粒中,淀粉含量一般在65%左右,而直链淀粉仅占总淀粉的25-30%。高淀粉玉米种植可明显增加农民收益；而高直链淀粉不仅具有重要的工业用途,也是一种具有保健功能的新型膳食纤维。因此,加强高淀粉和/或高直链淀粉玉米的培育有重大的社会效益和经济效益。我国高直链淀粉玉米种质资源十分缺乏,直链淀粉主要依赖以昂贵的价格进口。采用常规育种方法很难打破高直链淀粉性状与其它不良籽粒性状的连锁关系。因此,利用转基因手段创制高淀粉和/或高直链淀粉玉米新种质受到国内外学者的重视。本论文以参与淀粉合成的关键酶基因为靶点,利用过表达或抑制表达的转基因策略,开展了高淀粉玉米和高直链淀粉玉米新种质的创制。SBEIIRNAi转基因玉米后代性状分析直链淀粉的合成是一个多酶催化的过程并且受到复杂的基因-环境互作的影响。淀粉分支酶(SBE)在调控淀粉分支水平中起核心作用。不同SBE家族的同工酶在控制分支点数目、链长分布以及直链淀粉/支链淀粉比例中具有清晰的功能分工,其中SBEIIb的活性大小直接影响玉米胚乳中直链淀粉的含量。本工作首先对不同的SBEIIRNAi结构转玉米株系进行了高直链淀粉性状的遗传稳定性分析,研究了SBEIIa和SBEIIb活性的降低对直链淀粉含量、淀粉分支链链长分布和淀粉粒形态的影响。在前期工作中,李宁等已通过分子检测、表达分析以及直链淀粉含量的测定筛选出不同SBEIIRNAi吉构转玉米纯合株系,论文中所涉及的10个hpSBEIIRNA干扰结构以ZmSBEII亚家族为靶标,以达到抑制SBEII活性的目的。这些干扰载体分为两组,分别用组成型P35S启动子或胚乳特异性启动子P27kD启动其表达。每组干扰载体中包含：两个载体分别以893 bp(bc)或467 bp(bd)的iBEIIb保守区序列为靶序列(相应的转基因株系分别命名为P35bc、P35bd、P27bc、P27bd),两个载体分别以417 bp SBEIIa特异区+295bp SBEIIb特异区的融合片段(ac)或417 bp SBEIIa特异区+154 bp SBEIlb特异区的融合片段(ad)作为干扰结构的臂序列(相应的转基因株系分别命名为P35ac. P35ad.P27ac.P27adl,另外一个载体以893 bp的SBEIIb保守区序列为靶序列并将干扰结构中内含子部分(chalcone synthase intron,CHSA intron)用改造过的过氧化氢酶基因的第一个内含子替换(相应的株系命名为P35in’或P27in’)。凝胶渗透色谱法(GPC法)测定结果显示,在各S BEIIRNAi转基因株系中,P27ac株系的籽粒直链淀粉含量增幅最大,占总淀粉含量的55.89%,几乎是WT植株直链淀粉含量的2倍。P27ad株系的直链淀粉含量为51.95%,显著高于P27bc和P27bd转基因株系的直链淀粉含量(分别为46.24%和44.78%).P27bc.P27in’和P27ad株系的直链淀粉含量(分别为46.24%、48.26%和51.95%)均明显高于其相应的P35bc.P35in’P35ad株系(分别为41.86%、45.31%和46.83%)。P35in’和P27in’转基因株系的直链淀粉含量(分别为45.31%和48.26%)略高于P35bc和P27bc株系(分别为41.86%和46.24%,其hpRNA载体含有查尔酮合成酶内含子)。并且直链淀粉含量的增加与各转基因株系ZmSBEII基因表达量以及SBE酶活性成负相关(李宁2011)。这一测定结果与李宁等(2011)碘结合法测定的结果基本一致。GPC结果还显示与未转基因对照相比,转SBEIIRNAi结构株系的籽粒淀粉脱分支后,F1组分包含更多且链长更长的直链淀粉分子,并且组分F2与F3的比例在转基因株系中更高。即转SBEIIRNAi结构玉米籽粒中,不仅直链淀粉含量显著增加,而且支链淀粉中的支链的长度也明显增加。在转SBEIIRNAi结构株系胚乳中,随着直链淀粉含量的提高,淀粉粒的形态也发生了明显变化,如表面呈现不规则的塌陷,淀粉粒大小不均一等特征。在以ZmSBEII保守区域为干扰靶序列的转基因株系P35bc.P35in’.P27bc.P27bd和P27in’中,淀粉粒表面呈现出轻微的不规则突起,有的变为多角形；而P35ad.P27ac和P27ad株系中淀粉粒表面呈现出较多的凹陷。这些结果表明,淀粉组成成分比例的改变显著影响了淀粉粒的形态结构,同时也会影响籽粒中粉质胚乳和角质胚乳的比例。相比于WT植株,各转基因株系的籽粒大小有不同程度的降低,并且与直链淀粉含量成负相关。但是,转基因株系的籽粒未发生严重的皱缩,籽粒性状明显不显著,基本保持了受体自交系楔形马齿状籽粒形态。测定不同转SBEIIRNAi结构株系的T5代植株的籽粒直链淀粉含量,得出其籽粒直链淀粉含量与它们的T3代植株测定值相近,同时株型也没有发生明显变化。这说明转SBEIIRNAi结构对玉米籽粒直链淀粉含量的影响以及由此导致的高直链淀粉性状能够在转基因植株后代中稳定遗传。这些工作为玉米RNAi结构的设计和高直链淀粉玉米育种积累了重要资料。过表达突变型AGPase提高玉米淀粉含量和籽粒产量在淀粉合成过程中,AGPase是重要的限速调节酶。玉米中,AGPas e是由两个大亚基和两个小亚基构成的异源四聚体,85%的AGPase为胞质型,并且受3-PGA的激活作用和Pi的抑制作用调控,分别由Sh2和Bt2编码其大亚基和小亚基。突变型Sh2r6hs基因所编码的大亚基包含两个位点突变(其编码氨基酸第333位的组氨酸突变为酪氨酸和在第476位氨基酸后插入酪氨酸和丝氨酸),与小亚基的相互作用更强,并且使AGPase对Pi的抑制作用敏感度降低。本工作利用重叠引物延伸法获得了突变型AGPase大亚基编码基因Sh2r6hs,选用玉米胚乳特异性启动子P22kD和P27kD分别驱动Sh2r6hs基因和Bt2基因的表达,构建出Sh2r6hs单基因过表达载体和与Bt2基因串联的过表达植物载体,采用农杆菌介导的玉米芽尖转化方法转入优良自交系昌7-2和郑58。PCR和real-time RT-PCR检测证明,外源基因在转基因玉米株系中稳定遗传,且表达稳定。经多代筛选,选择出纯合株系用以研究Sh2r6hs以及Bt2过表达对玉米胚乳中AGPase酶活性、淀粉合成、籽粒表型及产量的影响。从不同灌浆时期(10、15、20、25 DAP)的果穗剥取籽粒,对目标基因的表达水平和AGPase酶活性进行分析。各株系中Sh2和Bt2的表达丰度随着灌浆时间的增加而增加,在授粉后20天时达到最高峰,继而降低。相比于未转基因受体自交系,入选的各转基因株系目标基因的表达强度均明显提高,增加幅度在不同株系间有差异。AGPase活性也随着灌浆的进程而增加,在授粉后20天达到最高峰,随后下降。入选的转基因株系AGPase酶活性明显高于受体自交系的。转双基因株系的酶活性也明显高于转单Sh2r6hs基因株系的。测定授粉后20天籽粒AGPase酶活性,发现在45℃下各株系AGPase活性较30℃时降低。相比于30℃下的酶活性,昌7-2在45℃下的酶活性仅保留64.99%,而转基因株系Sh2r6hsBt2-C-47酶活性为30℃时的77.59%；郑58 AGPase活性在45℃下为30℃时的60.96%,而转基因株系Sh2r6hsBt2-Z-80的酶活性保留了76.85%。即转基因株系AGPase酶活性在高温条件下仍显著高于受体自交系的。对转基因纯合植株及其受体自交系的成熟籽粒进行淀粉含量和百粒重测定,发现与受体自交系昌7-2相比,Sh2r6hs-C-250植株的籽粒淀粉含量由昌7-2的64.18%增加到70.40%,差异达到显著水平；双基因串联的转基因株系Sh2r6hsBt2-C-47的籽粒淀粉含量增加到77.05%；在郑58背景下,双基因串联的转基因株系的淀粉含量由昌7-2的64.9%增加到Sh2r6hsBt2-Z-80株系的77.36%。同时,转基因植株的百粒重也有明显提高,与对照昌7-2相比,转基因株系的百粒重分别提高14.6%(Sh2r6hs-C)和23.3%(Sh2r6hsBt2-C);与对照郑58相比,转基因株系的百粒重提高9.49%(Sh2r6hsBt2-Z)。通过不同株系植株的盆栽和大田比较试验得出,转基因植株生长正常,单株产量较非转基因植株有明显提高。本工作中,过表达突变型大亚基基因Sh2r6hs或与Bt2基因共表达都能够提高胚乳AGPase活性、淀粉含量和籽粒产量,双基因过表达时淀粉含量和籽粒产量相对增加更高。Sh2r6hs基因与Bt2基因共表达可形成更多的稳定四聚体,减轻高温胁迫和Pi对AGPase舌性的抑制,促使更多的可溶性糖类被合成淀粉,拉动碳水化合物从“源组织”向“库组织”分配,导致籽粒产量增加。本工作采用Sh2r6h s基因代替Sh2基因的策略进行过表达材料的创制,既可有效地减轻抑制因子对AGPas e活性的影响,增加淀粉合成,又能促进果穗及籽粒性状的改变,为培育玉米优良自交系提供了一个切实可行的途径。过表达GBSSI提高籽粒直链淀粉含量和产量直链淀粉主要是由颗粒结合型淀粉合成酶GBSSI负责合成的。GBSSI功能的完全缺失将导致直链淀粉含量严重降低,甚至致使淀粉中仅含有100%的支链淀粉。在玉米胚乳中过表达GBSSI编码基因ZmWx有望提高GBSSI的活性,增加直连淀粉合成。本工作采用RT-PCR方法从玉米胚乳cDNA中克隆出玉米GBSSI编码基因ZmWx,选用玉米胚乳特异性启动子P27kD驱动其表达,以除草剂抗性基因als为选择标记,构建出ZmWx单基因过表达的植物转化载体。采用农杆菌介导的玉米芽尖遗传转化方法,将其转入玉米骨干自交系昌7-2和郑58。PCR和real-time RT-PCR检测表明,转基因ZmWx在转基因玉米植株后代中稳定遗传和表达表达。通过多代筛选,选择出转基因纯合株系用以研究GBSSI过表达对玉米胚乳中目标基因转录水平、酶活性、淀粉组成、籽粒表型及产量的影响。从不同转基因株系和其受体自交系植株的果穗上剥取籽粒,取样时间为授粉后的10、15、20、25、30、35天(DAP),测定目标基因表达水平和GBSSI活性。ZmWx基因转录本的丰度随着灌浆时间的增加而升高,在授粉后第30天时达到最高峰,继而降低。与受体自交系相比,转基因株系中ZmWx基因的表达强度显著提高,但增加幅度在不同转基因株系之间有差异。在转基因株系和受体自交系中,GBSSI活性随着灌浆的进程而增加,在授粉后35天达到高峰。与受体自交系相比,入选的转基因株系的GBSSI活性均显著提高,直链淀粉含量也显著增加。在昌7-2背景下,ZmWx转基因株系Wx-C的直链淀粉含量由受体自交系的25.3%增加至35.8-41.1%,其中转基因株系Wx-C-5增幅最大,提高到41.1%。在郑58背景下,ZmWx转基因株系Wx-Z的直链淀粉含量由受体自交系的26.4%增加至35.3-41.9%,其中转基因株系Wx-Z-20直链淀粉含量最高,达到41.9%。并且,与受体自交系相比,ZmWx转基因株系籽粒的淀粉含量没有降低,且略有增加,部分转基因株系籽粒中淀粉含量的提高达到差异显著水平。其中转基因株系Wx-C-1(由受体自交系的64.18%增加至71.18%)租Wx-Z-6(由受体自交系的66.21%增加至71.24%)的淀粉含量最高。转基因植株的百粒重也有明显提高,在昌7-2背景下,ZmWx基因过表达使百粒重从受体自交系的22.06±0.4 g提高到Wx-C-1株系的24.96±0.64 g,增加了13.14%,达到差异极显著水平。在郑58背景下,ZmWx转基因株系的百粒重由受体自交系的29.22±1.23g增加至Wx-Z-6株系的34.17±1.14 g,提高了16.94%,差异达到显著水平。不同株系植株的比较试验得出,转基因植株生长正常,穗行数与受体自交系的差异不显著,而果穗长、行粒数、百粒重以及单株产量较受体自交系植株有明显提高。ZmWx基因在玉米胚乳中过表达,使GBSSI活性显著升高,这意味着胚乳细胞中存在着更多的活性GBSSI蛋白。据报道GBSSI蛋白随着淀粉粒的生长而被索定在其中,不能像其它淀粉合成酶那样在淀粉体基质中移动,在细胞发育到一定阶段后,其周围可被利用的底物数量受限,因此,增加GBSSI蛋白在淀粉半晶质结构中的丰度是提高胚乳细胞直链淀粉合成能力的有效途径。本工作中,转ZmWx基因株系中直链淀粉含量的升高并没有伴随总淀粉含量和籽粒重量的降低,相反,部分株系籽粒淀粉含量和百粒重明显增加。很可能在胚乳发育的较早阶段,超量的GBSSI蛋白合成不仅能增加直链淀粉合成,有可能影响淀粉粒形成及结构,促使更多碳水化合物在籽粒中转化和积累,提高籽粒产量和百粒重。突变型AGPase与GBSSI过表达转基因聚合玉米的性状初步分析由于GBSSI控制直链淀粉合成的能力,还受到底物ADPG浓度等因素的制约。为了解在ADPG充足供应情况下GBSSI过表达能否进一步促进直链淀粉的合成,将郑58背景的突变型AGPase过表达的高淀粉玉米与GBSSI过表达玉米进行杂交,获得转基因聚合体。以转基因聚合体、聚合体亲本株系和受体自交系郑58为材料,取不同灌浆时期(10、15、20、25、30、35 DAP)的玉米胚乳进行Sh2、Bt2和ZmWx基因的表达分析和AGPase、GBSSI酶的活性测定。确定了转基因亲本株系和聚合株系中Sh2、 Bt2和Wx基因的表达强度均高于郑58；在过表达突变型AGPase玉米为母本的转基因聚合株系中胚乳Sh2、 Bt2的表达强度高于以过表达GBSSI株系为母本的聚合株系的,但低于过表达突变型AGPase亲本的。与之类似,以过表达GBS SI株系为母本的聚合株系中ZmWx基因的表达丰度高于以过表达突变型AGPase株系为母本的聚合株系的,但低于过表达GBSSI亲本的。AGPase和GBSSI酶活性、淀粉含量和直链淀粉含量也呈现出类似的变化趋势。推测转基因玉米胚乳中转基因拷贝数在一定程度上影响转基因的转录丰度和编码的酶活性,细胞内转基因的拷贝数为3,转录本丰度及编码的酶活性最高。综上所述,本论文工作对采用RNAi技术获得的高直链淀粉玉米后代的胚乳淀粉组成和淀粉粒形态进行了分析,进一步肯定了不同RNAi结构对靶基因表达的抑制效果；检测了高直链淀粉性状的遗传稳定性,获得了高直链淀粉玉米新种质。同时,利用过表达突变型AGPase大小亚基的方法创制出淀粉含量和籽粒体积显著增加的高淀粉玉米新种质；利用过表达ZmWx基因的方法提高了玉米籽粒直链淀粉的合成,获得淀粉含量和直链淀粉含量显著增加的转基因玉米新种质,并通过杂交聚合的方式实现过表达突变型AGPase基因和ZmWx基因在玉米胚乳中共表达,为进一步选育高淀粉、高直链淀粉玉米种质提供了优异材料,也为玉米胚乳淀粉合成机制的深入研究积累了重要资料。这些尝试不仅为转基因高淀粉玉米、高直链淀粉玉米和高淀粉高直链淀粉玉米的创制提供了有效策略和方法,而且选育的优良材料具有应用前景。