【摘 要】
：
背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性（异质性）成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyltransferase,APRT）作为生物体内ATP合成中嘌呤补救途径的关键酶,不仅参与生物体嘌
论文部分内容阅读
背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性（异质性）成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyltransferase,APRT）作为生物体内ATP合成中嘌呤补救途径的关键酶,不仅参与生物体嘌呤的合成代谢,还对基因沉默引起的基因表达具有重要的影响。因此,本研究通过基因编辑并筛选获得aprt基因敲除的CHO细胞系及研究其对重组蛋白表达的影响,以期最终建立一个基于APRT缺陷型细胞系的高效表达目的蛋白的基因扩增系统。目的采用CRISPR/Cas9基因编辑（gene editing）技术,敲除CHO细胞的aprt基因并筛选获得APRT缺陷型CHO细胞系,研究缺陷型细胞对重组蛋白表达的影响。方法（1）Aprt基因敲除及验证:根据CHO细胞aprt基因组序列设计并合成sg RNA,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除aprt基因,利用PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等方法鉴定基因敲除是否成功。（2）APRT缺陷型CHO细胞生物学特性验证:通过观察细胞形态和生长状态,进行生物学特性验证缺陷型CHO细胞系能否进行正常的生长和传代。即分别采用CCK-8法和倍增时间计算,检测缺陷型细胞的增殖情况;流式细胞术检测缺陷型细胞的凋亡情况。（3）重组蛋白真核表达载体的构建:以本实验室构建的表达报告基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,e GFP）真核表达载体为基础载体,在e GFP表达盒上游插入含有SV40启动子弱化或（和）aprt基因起始密码子突变的APRT表达盒,分别命名为弱化表达载体和突变表达载体;相应的目的蛋白真核表达载体是将e GFP分别替换为人玻连蛋白（human vitronectin,VN）或阿达木单抗（adalimumab,ADM）基因序列。将构建好的上述真核表达载体分别转染野生型和APRT缺陷型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池（cell pool）。（4）重组蛋白表达分析:转染筛选获得重组CHO-e GFP细胞池传代培养60代并用流式细胞术检测e GFP表达的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）,比较不同实验组e GFP的表达稳定性。转染筛选获得重组CHO-VN、CHO-ADM细胞池,并通过Western Blot比较不同实验组重组蛋白的表达量。结果（1）PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等检测结果表明,aprt基因DNA片段缺失141 bp,成功敲除CHO细胞aprt基因。（2）与野生型CHO细胞,获得的APRT缺陷型CHO细胞系,在细胞形态、细胞增殖和凋亡以及细胞的倍增时间无显著区别（野生型:17.69±0.3 h,APRT缺陷型:17.99±0.2 h）（P＞0.05）。这些结果表明,aprt基因的敲除对CHO细胞的生物学特性无明显影响。（3）瞬时转染和稳定转染的细胞池检测结果表明,与重组野生型CHO细胞相比,e GFP在重组APRT缺陷型CHO细胞系中的表达显著提高（P＜0.05）。（4）长期传代培养结果表明,在杀稻瘟菌素加压或不加压的情况下,转染弱化载体或突变载体的缺陷型细胞能够显著提高e GFP蛋白的表达量（P＜0.05）。其中,转染突变载体的缺陷型细胞的e GFP表达量最高,其MFI是转染对照载体的野生型细胞的2.02倍。转染突变载体的两组重组CHO细胞表达e GFP较为稳定,e GFP蛋白的长期表达维持率均高于70%。（5）重组目的蛋白VN和ADM在缺陷型CHO细胞中的表达量均高于对照野生型CHO细胞。结论（1）通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了APRT缺陷型CHO细胞系,缺陷型细胞系与野生型CHO细胞在生物学特性方面无显著差异。（2）获得的APRT缺陷型CHO细胞系能够显著提高重组蛋白表达水平和表达稳定性,为最终建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的基因工程策略。
其他文献
随着全球新能源行业革命的加速推进、风电装机量的持续增长及存量风电机组规模的不断扩大，平价时代背景下风电机组服役期间保障发电量的重要性越发凸显，因此叶片例行检查维修对于保持机组叶片健康稳定运行至关重要。基于此，中铝宁夏能源集团银星能源股份有限公司大力推行创新，发明一种风电机组叶片内部巡检设备，该文对此设备的创新与应用展开阐述。
＜正＞“探索浩瀚宇宙,发展航天事业,建设航天强国,是我们不懈追求的航天梦。”卫星应用产业作为航天战略性新兴产业,具有综合技术强、系统集成性高的特点,对于维护国家安全、促进科学技术进步、带动经济社会发展具有重要的意义。近年来,卫星应用产业发展迅速,发展环境逐步优化,经济规模保持两位数增长态势,市场主体日益多元。卫星应用正在持续为满足人民对美好生活的需要和期待提供重要支撑,为国民经济各行各业注入新的活
《关于建立国土空间规划体系并监督实施的若干意见》确立了"五级三类四体系"的总体框架,亟待加快市县及以下国土空间规划体系的探索创新。在系统梳理南京现行城乡规划体系和土地利用规划体系特点、问题的基础上,结合国家、省要求与南京工作基础,尝试构建适用于南京的国土空间规划编审体系,以市、分区、街镇三级总体规划和开发边界内外的详细规划、村庄规划实现全域覆盖,并通过构建两层级的专项规划体系强化与详细规划的联动传
我国农业生产中化肥过量施用较为普遍，肥料利用率不高，资源浪费，环境污染等问题时有发生。十三五期间国家开展了多项化肥减量增效行动计划，取得了积极成效，生产层面基本实现了化肥消费总量零增长目标，但化肥绿色增效的基础理论研究与技术创新不足，推广应用覆盖面不够，政策法规仍有待完善。当前我国化肥减量增效工作步入了全面攻坚期，本文调查分析了国际化肥减量增效的经验，总结了我国前期化肥减量增效工作取得的成效和存在
＜正＞党的二十大报告指出,我国一些关键核心技术实现突破,战略性新兴产业发展壮大,载人航天、探月探火、卫星导航等取得重大成果,进入创新型国家行列。11月,中国空间站“T”字基本构型在轨组装完成,向着建成空间站的目标迈出了关键一步。《新时代的中国北斗》白皮书发布,全面展示了北斗系统进入新时代以来,形成的服务新能力、产业新发展、开放新格局、未来新征程。第十四届中国国际航空航天博览会在广东珠海开幕,“高、
目前大多传统媒体受工作模式等的影响，无法融入新的传播体系，满足受众多样化的需求。基于此，分析融媒体视域下主流新闻传播的路径模式，论述主流新闻传播工作在新媒体背景下的变化和现存问题，明确未来的发展方向，以期更好地实现传统媒体的优化，加强主流新闻传播效果。
＜正＞近年来,随着中国邮政集团有限公司和云南省邮政分公司开展文化主题邮局建设的稳步推进,昆明邮政分公司深度挖掘地方独有的文化资源优势,积极引入第三方优质资源,通过市场化机制,以"邮政企业+第三方运营公司+员工领创"等多方联合的运营模式,注重将"邮"文化与地方特色文化相融合,在综合各项邮政业务的基础上发挥创意的力量,先后打造了讲武、孔雀、古滇、鲜花、"梨"好等具有地方文化特色的主题邮局。这些主题邮局
目的 通过研究异地就医联网结算政策下四川大学华西医院住院患者医保报销比例的差异性，探讨影响报销比例的因素，分析各类因素对报销比例的影响，为完善异地就医联网报销政策提供实证依据。方法 采集2019年1月—2020年12月医保联网即时结算的参保患者报销费用相关指标。对参保患者的报销比例按不同保险类型、不同地区、不同病种进行因素分析。对各类参保患者分别采用随机森林模型建立其报销比例与影响因素之间的联系，
以天津市滨海新区网格化管理工作为例，从网格化管理工作实施情况、运行机制、管理工作创新等方面分析了消防安全网格化管理的现状，论证了消防安全网格化管理的困境与存在的不足，提出了消防安全网格化管理工作的对策。
深度学习是培养和发展学生核心素养的重要途径,也是教育改革对时代挑战的主动回应。在高等教育学习任务和学习活动设置中,大学英语始终占据着非常重要的地位,是大学生学习的中心任务之一。而英语词汇深度学习对提升大学生词汇能力和英语能力非常重要。近几十年国内外对深度学习的研究主要集中在理论研究,仅少数学者进行了相关实证研究。在已有研究中,作者发现大多数大学生的学习方式还停留在浅层学习,缺乏深度学习能力,英语词