研究背景及目的：白血病是因造血干／祖细胞在分化过程中的不同阶段发生分化障碍,增殖旺盛、凋亡受到抑制从而引起的造血系统恶性肿瘤。越来越多的研究认为白血病的发生遵循“二次打击”学说。急性白血病(AL)的发生源于不同类型的基因同时发生突变。Ⅰ类基因异常赋予造血干细胞以增殖及生存优势,持续激活酪氨酸激酶或其下游分子；Ⅱ类基因异常累及在正常造血分化调控中起重要作用的转录因子,转录因子表达的异常造成它们功能丧失,使造血细胞分化受阻和随后的凋亡受抑。这两类异常共同导致了白血病细胞持续增殖、生存以及分化受阻,从而引起急性白血病,可见转录因子在白血病的发生发展中起着至关重要的作用。在众多的转录因子中,CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPa)及CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因通过促进造血干／祖细胞向粒系分化并抑制细胞增殖,在造血系统早期分化过程中起重要作用。C/EBPa在造血细胞自身的增殖、凋亡、细胞周期、细胞分化等方面具有高度的调节作用,C/EBPa在急性髓系白血病中发挥着原癌基因的作用,在急性淋巴细胞白血病中发挥着抑癌基因的作用。CEBPA基因的突变及其在转录、翻译及翻译后水平受到的异常调控可引起C/EBPa结构异常,从而导致粒系细胞分化成熟的障碍、不成熟粒系前体细胞异常地增殖,这是急性髓系白血病(AML)的重要发病机制。转录因子PU.1是Ets家族的一员,Kueh等认为B细胞的成熟有赖于PU.1表达的降低,而巨噬细胞的形成则有赖于PU.1表达的升高,同时PU.1在调节造血细胞的周期中也起着重要的作用。另外,PU.1与C/EBPa作用相似,在急性髓系白血病中发挥着原癌基因的作用,在急性淋巴细胞白血病中发挥着抑癌基因的作用。在造血干细胞形成及粒系和单核系的分化起重要作用,它们相互之间的比例决定向粒系或单核系分化,PU.1表达较高则向单核巨噬细胞分化。已有研究表明,在3T3中过表达C/EBPa与PU.1,3T3能向巨噬细胞转化,且具有趋化的功能,也有研究认为过表达C/EBPa能增加3T3细胞的氧化应激能力,并减少脂肪的生成,同时PU.1的表达在脂肪细胞谱系中也起着重要的作用。在急性B淋巴细胞白血病中,过表达C/EBPa与PU.1,B细胞也能向巨噬细胞转化,且具有完整的趋化和吞噬的功能。目前,成人急性T淋巴细胞白血病预后仍较差,人为地过表达C/EBPa与PU.1后,白血病细胞如能转化为具有趋化和吞噬功能的巨噬细胞,降低白血病的致癌性,将会给病人带来极大的福音。本研究以急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株为对象,通过逆转录病毒载体(pwpxld-gfp、pwpxld-C/EBPa-gfp、pwpxld-PU.1-gfp、pwpxld-C/EBPa-PU.1-gfp)转染jurkat细胞株,建立稳定表达C/EBPa、PU.1与共表达C/EBPα、PU.1的细胞株(以下简称jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp),并研究过表达C/EBPa与PU.1后对jurkat细胞株增殖、凋亡、细胞表面标志抗原的变化等生物学性状的影响。将细胞(jurkat-gfp、jurkat-C/EBPa-gfp、 jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp)通过尾静脉注射入免疫缺陷的NSI小鼠体内,观察小鼠生物学行为的改变、生存时间及各脏器白血病细胞侵犯的程度。从体外和体内实验两方面研究急性淋巴白血病jurkat细胞株能否通过转录因子表达的增高向单核巨噬细胞转化,从而降低致癌性,延长生存期,同时也部分解释临床上急淋与急非淋相互转化的机制,为更深层次了解白血病做基础。材料和方法：将已构建好的逆转录病毒载体扩大培养,提取质粒并进行酶切鉴定。将获得的重组病毒载体pwpxld-gfp,pwpxld-C/EBPa-gfp, pwpxld-PU.1-gfp, pwpxld-C/EBPa-PU.1-gfp质粒转化至DH5a感受态细菌中,均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上,倒置放置于37度孵箱中培养过夜。次日挑取单个菌落,放置于2m1含有氨苄青霉素LB的液体培养基中,放置于摇床上,37度,210转／分,培养12-16h。提取质粒,酶切鉴定,明确已构建好的逆转录病毒载体是否正确,有无发生突变。采用脂质体法,将酶切鉴定正确的质粒通过293T细胞包装病毒,收集病毒上清,感染jurkat细胞株,建立过表达C/EBPa与PU.1的jurkat细胞系,并通过QRT-PCR法鉴定转录因子的表达。通过检测细胞增殖、细胞凋亡、细胞表面标志抗原的变化等了解C/EBPa、PU.1对jurkat生物学性状的影响。通过粒系相关细胞因子(GM-CSF、M-CSF、IL-3、FLT-3L)的辅助,观察过表达转录因子的细胞能否转化为贴壁的巨噬细胞,并以瑞氏染色的酵母菌检测巨噬细胞趋化和吞噬的功能,RT-PCR法检测巨噬细胞相关髓系基因的表达,细胞学染色、化学染色观察细胞形态,有无髓系标志,并使用BCIP/NBT试剂盒检测巨噬细胞碱性磷酸酶的存在。将过表达C/EBPα、PU.1的细胞通过尾静脉注射入免疫缺陷小鼠体内,观察小鼠生物学行为的改变以及生存时间。通过流式细胞仪检测各脏器白血病细胞侵犯的程度,细胞化学染色、免疫组化等方法观察细胞的转化程度,进一步验证转录因子C/EBPα、PU.1对急性淋巴细胞白血病jurkat细胞株生物学性状的影响。1、逆转录病毒载体酶切鉴定。将逆转录病毒载体pwpxld-gfp, pwpxld-C/EBPa-gfp,pwpxld-PU.1-gfp, pwpxld-C/EBPa-PU.1-gfp在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养12-16h后,应用质粒提取试剂盒提取质粒,测定质粒浓度。根据质粒图谱选择适当的快切酶进行双酶切,37度在孵箱孵育30min后,选择合适的DNA Marker,1%凝胶220v电压,40min电泳,观察条带的大小并拍照。2、逆转录病毒包装,转染jurkat细胞株及转录因子相对表达量的测定。通过脂质体法三质粒包装系统利用293T细胞包装病毒,观察293T细胞在荧光显微镜下gfp表达情况,收集24h,48h,72h病毒上清,感染jurkat细胞。感染后48h在荧光显微镜下观察gfp表达情况,72h后应用流式细胞仪分选gfp阳性的jurkat细胞,培养后将处于对数生长期的jurkat细胞提取RNA,逆转录为cDNA,QRT-PCR法鉴定jurkat-gfp, jurkat-C/EBPa-gfp、urkat-PU.1-gfp、 jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp等四种细胞C/EBPα、PU.1的表达情况。3、观察C/EBPα、PU.1转录因子对jurkat细胞株生物学性状的影响：对稳定表达C/EBPα、PU.1的细胞通过测定细胞增殖、细胞凋亡、细胞表面标志抗原表达的变化,细胞形态的改变及有无髓系相关基因的表达等了解过表达C/EBPα、PU.1后对jurkat细胞生物学的影响。4、观察髓系相关细胞因子刺激对过表达C/EBPα、PU.1细胞的影响。在分选后的gfp-jurkat、jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞培养基中加入髓系相关细胞因子(GM-CSF、MCSF、IL-3、FLT-3L),调整细胞因子浓度为100ng/mL。通过流式细胞仪观察细胞表面标志抗原的变化,荧光显微镜下观察细胞形态的改变,细胞染色、化学染色、BCIP/NBT碱性磷酸酶试剂盒观察和检测细胞有无髓系相关特征。5、瑞氏染色酵母菌,观察转化后巨噬细胞的趋化和吞噬功能。将毕赤酵母菌在琼脂YPD(右旋葡萄糖培养基)上4度倒置培养过夜后,次日挑取较大的菌落在液体YPD培养中培养12-16h后,将菌液高温灭活酵母菌。灭活后菌液离心,弃去上清,加入瑞氏染液染色过夜。次日菌液离心,用无菌PBS反复冲洗至上清液澄清,加入PBS至菌液浓度为1*10^6至1*10^7/ml。将转化后巨噬细胞接种于六孔板中,处于对数生长期时加入400u1已配置好的菌液,继续培养12h后,在荧光显微镜下观察巨噬细胞趋化和吞噬功能并拍照,弃去培养基,用PBS反复冲洗3次,找到与之前拍照同一视野再观察并拍照。6、观察稳定表达C/EBPa与PU.1的jurkat细胞在体内是否能够实现淋系向髓系的转化。将过表达C/EBPa、PU.1的细胞利用流式分选仪分选出gfp阳性的细胞,将jurkat-gfp、jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞计数,尾静脉注射2*10^6个细胞入NSI小鼠体内,观察小鼠生物学行为(步态、精神、毛发、眼睛、食欲)改变,发病的情况,生存时间的长短和频死前外周血、肝脏、脾脏、骨髓白血病细胞侵犯的程度。细胞瑞氏染色、过氧化物酶(POX)染色及免疫组化观察细胞转化的程度。7、统计学分析：应用SPSS 20.0进行数据分析,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05示差异有统计学意义。结果：1.质粒扩大培养后,经酶切鉴定,电泳后比对质粒图谱,电泳条带大小正确,证实质粒结构正确,无突变。2.脂质体法利用三质粒病毒包装系统将pwpxld-gfp,pwpxld-C/EBPa-gfp, pwpxld-PU.1-gfp,pwpxld-C/EBPa-PU.1-gfp质粒转入293T细胞中,24h即可看到有绿色荧光表达。将收集后的病毒上清感染jurkat细胞,48h后可检测到jurkat-gfp细胞gfp表达量约为100%,jurkat-PU.1-gfp细胞gfp表达量约为80%,jurkat-C/EBPa-gfp细胞gfp表达量约为60%,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞gfp表达量约为20%。应用流式分选仪分选gfp阳性细胞后,提取RNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR法证实jurkat-C/EBPa-gfp组C/EBPa表达量为jurkat-gfp的5倍,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组C/EBPa表达量为jurkat-gfp的4倍。Jurkat-PU.1-gfp组PU.1的表达量为jurkat-gfp的3.5倍,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组PU.1的表达量为jurkat-gfp的1.5倍。jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组PU.1的表达量为C/EBPa表达量的6倍。3.流式细胞术结果显示：分选gfp阳性细胞后扩大培养,jurkat-gfp组CD3阳性率约为90%,CD11b几乎不表达,jurkat-PU.1-gfp组CD3阳性率可降至40%,CD11b阳性率最高达30%,jurkat-C/EBPa-gfp组CD3阳性率可降至70%,CD11b基本不表达,jurkat-C/EBPa-PU.I-gfp组CD3阳性率可降至20%,CD11b阳性率最高达10%,各组CD3和CD11b表达量差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001)。4.分选gfp阳性细胞后各组加入细胞因子GM-CSF、M-CSF、IL-3、FLT-3L,各细胞因子浓度为100ng/mL。5天后,jurkat-gfp细胞仍为悬浮细胞,jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞均转变为贴壁细胞,胞体较大,伸出伪足。流式细胞学结果示贴壁细胞jurkat-PU.l-gfp组CD3阳性率约为30%,CD11b阳性率约为23%,jurkat-C/EBPa-gfp组CD3阳性率约为50%,CD11b阳性率约为4%,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组CD3阳性率约为20%,CD11b阳性率约为4%。分选gfp阳性细胞后各组加入细胞因子GM-CSF、M-CSF或者IL-3、FLT-3L,细胞因子浓度不变。各组细胞仍为悬浮细胞,与未加细胞因子组细胞形态并无明显差异。5.刃天青增殖实验结果显示：各组细胞在培养后72h内均呈不断增殖的趋势,不同时间点细胞增殖活性差异均有统计学意义(P<0.001),在Oh、24h、48h、72h等同一时间点,jurkat-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-gfp、 jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞的增殖活性差异有统计学意义,jurkat-C/EBPa-gfp组细胞增殖活性OD值最低。说明过表达C/EBPa抑制细胞的增殖。6.凋亡实验结果显示：jurkat-gfp、jurkat-PU.1-gfp细胞凋亡率较低,细胞增殖良好,jurkat-C/EBPa-gfp细胞在转染后dl天凋亡率已明显增多,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞d7天早期凋亡开始增加,各组凋亡率差异有统计学意义(P<0.001),可见过表达C/EBPa后细胞凋亡率明显增加,增殖受抑,过表达PU.1对细胞增殖没有明显的影响,C/EBPa与PU.1共表达时细胞凋亡率较C/EBPa组有所降低。7.细胞形态学结果显示：jurkat细胞胞浆丰富、呈深蓝色,有不规则瘤状突起,胞浆有空泡,无颗粒；核大、深染,呈不规则型。Jurkat-gfp与jurkat细胞形态相比差别不大。jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、 jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp细胞外浆蓝色、有瘤状突起。转化后的巨噬细胞,胞浆丰富,胞体较大,核仁模糊,有多个核仁,染色深染,胞质较粗。过氧化物酶(POX)染色结果显示：所有细胞均为阴性。8.巨噬细胞趋化和吞噬功能结果显示：将染色后的酵母菌与巨噬细胞共培养12h后,在荧光显微镜下可见到巨噬细胞明显趋化并吞噬酵母菌,PBS能将部分只被巨噬细胞趋化而尚未被吞噬的酵母菌冲洗掉。BCIP/NBT碱性磷酸酶检测试剂盒结果显示：Jurkat-gfp细胞胞质内均为弥漫红色,无蓝紫色颗粒沉淀。jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp转化后的巨噬细胞胞质内有蓝紫色颗粒沉淀,说明转化后的巨噬细胞有碱性磷酸酶的存在。9.髓系相关基因的检测：jurkat-PU.1-gfp与jurkat-C/EBPa-gfp组均表达髓系基因CD64,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp表达CD14,各组CD16表达量无明显增加,而淋系标志性基因BCL-11B与Gata-3均有明显的降低。转化后的巨噬细胞均有BCL-11B的明显降低,jurkat-PU.1-gfp组高表达CD 14,jurkat-C/EBPa-gfp组高表达CD16。10.NSI小鼠体内实验结果显示：NSI小鼠均在注射细胞后1-2月内发生白血病,发病时小鼠精神萎靡,毛发脏乱、易掉落,体重明显减轻,后肢瘫痪,食欲明显下降。Jurkat-gfp与jurkat-PU.1-gfp组小鼠平均生存时间较短,jurkat-C/EBPa-gfp组小鼠生存时间最长,差异有统计学意义。Jurkat-gfp组小鼠外周血、肝脏脾脏、骨髓细胞CD3阳性率约为90%,CD11b阳性率约为0。Jurkat-PU.1-gfp与jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp两组小鼠外周血、肝脏脾脏、骨髓细胞CD3阳性率约为70%,CD11b阳性率有部分升高。jurkat-C/EBPa-gfp组小鼠外周血、肝脏脾脏、骨髓细胞CD3阳性率约为60%,CD11b上升幅度最高。CD3阳性率的降低与CD11b的升高差异均有统计学意义。结论：对人急性淋巴细胞白血病细胞株jurkat过表达C/EBPa、PU.1后,细胞表面标志抗原CD3表达降低,CD11b表达升高,jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组CD3阳性率最低,jurkat-PU.1-gfp组CDllb阳性率最高。过表达C/EBPa后,细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加。在细胞因子GM-CSF、M-CSF、IL-3、FLT-3L的辅助下,jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.l-gfp、jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组细胞均能转化为贴壁的巨噬细胞,伸出伪足,且转化的巨噬细胞能够趋化并吞噬酵母菌,且细胞存在碱性磷酸酶。jurkat-C/EBPa-gfp、jurkat-PU.1-gfp、 jurkat-C/EBPa-PU.1-gfp组及转化后的巨噬细胞均低表达淋系相关基因,弱表达或高表达髓系相关基因。过表达C/EBPa与PU.1后在免疫缺陷NSI小鼠体内,jurkat能部分转化为巨噬细胞,降低jurkat的致癌性,延长小鼠的生存时间。