研究背景和目的在哺乳动物大脑,可增殖的神经祖/神经干细胞在适当的情况下可产生新的神经元并将其整合到现有的神经元环路,这一过程的存在称为神经再生,它可通过操纵内源性神经祖细胞的增殖和分化来提高细胞替代治疗各种神经退行性疾病的可能性。因此破解出调节神经再生的“合适条件”,使得内源性神经替代系统转化为治疗干预措施显得格外重要。生长因子是神经干细胞发挥功能的重要影响因素。在活体和培养系统内,多种细胞外生长因子已被证明可促进神经祖细胞的增殖和神经再生。神经营养因子属于生长因子家族,包括神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF), neurotrophin-3(NT-3)和neurotrophin 4/5(NT-4/5),可参与神经祖细胞的生存和增殖,在新生神经元的分化和迁移过程中的自我修复中起重要作用。其中,BDNF因为是中枢神经系统中含量最丰富、分布最广泛的神经营养因子而最为引人关注。BDNF几乎调节了神经元发育和功能的所有方面,包括诱导、增殖及分化。BDNF通过特异性结合和激活酪氨酸激酶受体(TrkB),或一个单一的泛神经营养因子受体(p75NTR)发挥作用。目前认为BDNF-TrkB信号在神经再生中起重要作用。在大脑的不同区域,BDNF或TrkB通过遗传或化学方法发生功能性变化积极参与神经再生的过程。体外,BDNF促进神经祖细胞的增殖,在神经细胞球培养中可增加神经元含量。尽管如此,BDNF如何促进神经再生,以及BDNF是如何影响神经前体细胞的增殖和分化目前仍未能达成共识。与之前的报道不同的是,我们用海马组织型切片培养(OHSCs)来探明BDNF对神经再生的影响。与传统的离体神经再生研究的神经元细胞培养相比,OHSCs似乎更适合研究体外新生和成年期的神经再生,因为OHSCs包含各种神经元和非神经元物质,与生理条件更相近；此外,OHSCs可在数周内保留大部分解剖通路、纤维联系和内在功能活性,可维护内源性神经元祖细胞自发生成新的神经元,可以更好的模拟在体生理功能。与在体研究相比,用OHSCs可以以在体无法达到的BDNF浓度进行精确的实验操作,并避免体内BDNF不能通过血脑屏障的缺点更直观的观察其药理作用,是很适合研究研究神经再生的载体。因此,在本研究中我们应用OHSCs研究BDNF对神经再生的影响。目前为止,只有少数生长因子,诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在OHSCs上显示出对神经再生的复杂影响。此外,现有研究强烈提示BDNF和其关联的受体TrkB参与调节了神经再生过程。因此,我们使用OHSCs来研究BDNF对神经再生的影响,用5-溴脱氧鸟苷(BrdU)标记法研究培养海马脑片的神经再生能力。神经细胞的神经元成熟由两个神经元标记物双肾上腺皮质激素(DCX)和神经元特异性核蛋白(NeuN)表示。通过计算由这两个标记物标记的阳性细胞,我们试图在OHSCs系统中重新评估BDNF对神经再生的影响,并探讨BDNF-TrkB的浓度及时长选择是否为神经再生的关键因素之一。在成年哺乳动物大脑的神经生长中心中,有自我更新能力的神经干细胞(NSCs)聚集于室管膜下区(SVZ)和海马颗粒下层(SGZ)。最近的研究表明,BDNF-TrkB对脑缺血可发挥神经保护作用,可显著促进由缺血诱导的神经再生,尤其是在海马SGZ。脑缺血可引起海马神经元死亡,也可引起反应性细胞增殖和神经再生增加,这被认为是神经元丢失的补偿机制。缺血诱导的神经再生机制仍不甚明了,需更多证据阐明。OHSCs系统是研究缺血诱导的神经再生的方便而可靠的工具。离体研究中,可以用氧葡萄糖剥夺技术(OGD)对OHSCs造成类似于缺血引起的损伤。本研究中,我们首次设计了一系列实验来证实OGD诱导的神经再生。缺血诱导损伤的强度与神经再生程度是否有关仍未确定,我们对培养脑片施以不同持续时间的OGD来诱导出正常、轻度及重度损伤,试图明确损伤强度和缺血诱导神经再生之间的关系。鉴于BDNF-TrkB信号对控制缺血诱导神经再生的重要性,我们进一步监测了OGD诱导损伤后BDNF和TrkB在OHSCs的表达,了解神经元损伤后BDNF-TrkB信号的变化及其与神经再生的相关性。方法动物本研究所用C57BL小鼠来自于广东省实验动物中心。所有操作及饲养均遵循人道原则尽量减少动物的痛苦及使用数量。符合广东省实验动物管理条例并通过实验动物伦理委员会审核。脑片培养海马脑片培养准备如既往研究所述,并稍做改进。取产后6天幼鼠,断头取脑,分离海马,迅速置于预冷的人工脑脊液(aCSF)中,此液配方为：NaCl 118mM,KCl2.5 mM, MgSO43 mM, NaH2PO4 1.1mM, NaHCO326 mM, CaCl2 1 mM和葡萄糖11 mM(所有试剂购自美国Sigma公司),置于95%02/5% C02饱和气体中。随后,用切片机(MA752,Campden仪器公司)切400μm厚冠状切片,取相邻的背侧海马冠状切片,每个培养板中放入1-2片以待培养。在体视显微镜下,将浸泡于预冷、氧合Hank’s平衡盐溶液(Gibco, Invitrogen公司)中的海马切片仔细分离,将没有明显损坏的脑片移至无菌多孔滤膜Millicell(Millipore公司),无血清培养基由50%MEM,18% HBSS,4mM L-谷酰胺,12 mM葡萄糖,4.5mM NaHCO3,20 mM蔗糖,100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素组成(所有试剂均购自Gibco或Sigma公司)。从每个海马中挑选部位匹配的脑片,随机分配到不同的培养条件组。由培养液中所用重组人BDNF(Immunological Sciences公司)和BDNF拮抗剂K252a(50 nM,Sigma公司)或TrkB-IgG(2ng/mL,R&D系统,)的不同浓度进行分组。碘化丙啶(PI)标记碘化丙啶(PI)是经典的细胞活性探针,在细胞膜破裂后进入细胞与DNA结合发出红色荧光。OGD处理后24小时,培养基内给予20μg/mLPI,5分钟后在荧光显微镜下观察并照相,以观察神经元受损死亡程度。BrdU处理为即时标记有丝分裂后细胞,我们对DNA合成标记物BrdU的处理方法大致遵照传统方式并略做改进。为确定合适的BrdU方案我们使用两种改进办法：第一种方法为在脑片制备30分钟前对活体动物进行单次的给药,将BrdU溶解在0.9% NaCl中,以50 mg/kg的剂量腹腔注射到幼鼠体内,此后脑片无需进行二次BrdU处理。第二种方法为BrdU处理两次。先将BrdU注射到老鼠体内,然后在在脑片体外培养阶段给予0.5 uMBrdU处理3天(DIV 0至DIV 3)。氧葡萄糖剥夺(OGD)处理常规OGD处理：OGD处理液由10 mM的甘露醇代替原有的培养基。在OGD处理前,OGD培养基加入6孔板,用95%N2和5%C02混合气体预饱和,并37℃预热。在正常培养的第8天(DIV 8),将海马脑片从无菌室中转移至预热的OGD培养基,并置于一个密封箱内,予95%N2和5%C02混合气体通气10分钟。箱密封后置于37℃孵育40分钟。40分钟后,重新置于原有培养基中继续培养。对照组使用正常培养基。免疫组织化学染色在体外培养第16天(DIV),在室温条件下将培养脑片固定在4%PFA 1小时,然后转移到30%蔗糖溶液中孵育24小时。随后将脑片置于37℃ 2 M HCl30分钟,在硼酸(0.1 M,pH 8.5)液中冲洗10分钟。然后将脑片在PBS中彻底洗净,用5%山羊血清与5%牛血清白蛋白封闭30分钟。做免疫组化：将脑片与羊抗BrdU抗体(1：50,Sigma公司),鼠抗NeuN抗体(1：50,Chemicon公司)或鼠抗GFAP (1:200, Sigma公司)抗体、或鼠抗DCX抗体(1：100,Sigma公司)双抗体在0.1%的Triton PBS孵育过夜,后在PBS彻底清洗3次共10分钟；之后在PBS中用羊抗兔TRITC(1:50, Chemicon公司)和羊抗鼠Alexa 488 (1:50, Chemicon公司)二抗孵育双染。对应的阴性对照组未见特异性的二抗染色。脑片在PBS多次洗脱后,用DPX(Sigma公司)封片。免疫印迹体外培养的切片(每同一实验条件下收集8个脑片)置于冷冻的RIPA缓冲液中匀浆。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific公司)做蛋白定量分析。从整个组织匀浆提取15ug蛋白置于SDS-PAGE(4-20%凝胶,Bio-Rad公司),并转移到PVDF转移膜(Millipore公司),分别用不同抗体标记,用增强化学发光剂(ECL)显色。使用Image J对免疫阳性条带进行光学密度测量并定量分析。统计学处理在徕卡DMRA2显微镜下用徕卡DFC300FX摄像头仔细观察,对整个切片进行计数。为确保每张切片细胞总数类似,只选择DAPI核染色平均密度及大小均近似的切片。量化实验中,每个脑片的编码和细胞计数由实验人员双盲检测及处理。统计分析和图形制作使用SPSS19.0软件(美国)。使用Excel绘图,结果用均值士标准差(mean±SD)表示。多组样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两比较或组间比较采用Bonferroni, LSD, Student-Newman-Keuls(在结果中已注明)。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.海马脑片培养中的神经再生为寻找一个更加优化的BrdU标记方法,本研究对文献报道的BrdU标记方法进行比较。我们应用两种方案给予BrdU:1)方案1,仅在取脑前对活体动物进行单次的给药(BrdU,50mg/kg);2)方案2,在方案1的基础上在脑片体外培养阶段给予0.5 uMBrdU处理3天(DIV 0至DIV 3)。两种方案均在DIV 16后进行脑片固定,利用抗BrdU抗体进行免疫荧光标记,结合神经元标志物DCX、NeuN和星型胶质细胞标志物GFAP进一步分析新生细胞的类型。用方案1标记BrdU,大于70%BrdU+细胞分布于齿状回的颗粒细胞层(GCL),其余细胞主要散在分布于门区、CA1和CA3区；用方案2标记BrdU, BrdU+细胞弥散于整个脑片,阳性细胞数大量增加。为了证实我们的推测,我们应用星型胶质细胞标志物GFAP与BrdU进行双重标记。应用标记方案2,每个脑片大约有213+29个BrdU+细胞,大量BrdU+(>85%)细胞表现为GFAP阳性。因此,BrdU+/GFAP+细胞可反应胶质细胞的增殖水平。我们进一步利用成熟神经元的标记物NeuN与BrdU进行双重标记,仅有极少数细胞(平均8±2.3,n=6)表现为NeuN+/BrdU+,阳性细胞主要分布在齿状回颗粒细胞层,在CA1和CA3区数量极少。这些NeuN+/BrdU+细胞的BrdU信号表现为染色质的斑点样改变。与之相区别,GFAP+/BrdU+细胞的BrdU信号表现为均匀的片状深度染色。这些染色特征对快速判断新生神经元具有重要作用。2. BDNF-TrkB信号与神经再生的关系目前,BDNF在海马脑片中的神经再生作用尚未见报道。因此,为了阐明BDNF在细胞增殖与分化的作用,我们应用上述BrdU标记方案2,在培养过程中加入梯度浓度的BDNF (1,10,20,40,80,160,320ng/mL),在培养16天后(DIV16)进行免疫荧光双标记鉴定,以研究BDNF对神经元的影响。不同的免疫标志物(NeuN, DCX, GFAP)分别与BrdU进行双重标记,对双重标记的细胞进行计数。BDNF的补充导致BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+细胞数增加,呈现一定的浓度依赖性。与对照组相比,高浓度(40～320 ng/mL)补充BDNF导致的新生神经元细胞数增加有统计学意义(P<0.05,n=6),峰值响应在80 ng/mL. BrdU+/DCX+细胞数量是BrdU+/NeuN+细胞数量的3～4倍。分析新生的BrdU+/GFAP+星形胶质细胞的数量,在不同浓度BDNF补充的培养基中没有看到显著变化(P>0.05,n=6)。我们进一步用特异性酪氨酸激酶TrkB抑制剂K252a和BDNF清除剂TrkB-IgG阻断BDNF-TrkB信号以明确BDNF的作用。结果表明,BDNF-TrkB信号的双封闭虽然不能完全消除补充BDNF的影响(与对照组相比P<0.05,n=6),但可削弱新生神经元数量的增加(将BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+细胞数汇总,与80 ng/mL BDNF相比p<0.05,n=6)。为了解内源性BDNF在神经再生的重要性,我们用K252a和TrkB-IgG处理脑片,并且不补充外源性BDNFo结果表明K252a对脑片的存活没有影响,但与对照组相比可显著降低神经再生。3.在海马脑片培养中外源性BDNF补充的时机选择鉴于BDNF-TrkB信号的增强可以促进神经再生,我们进一步研究了在培养过程中BDNF和TrkB表达的动态变化。使用不补充外源性BDNF、其他培养条件不变的培养脑片作为对照组,我们研究了培养脑片BDNF和TrkB蛋白水平的改变。BDNF的表达在培养后第二天先是减少到35%,然后反弹约60%(P<0.05,n=4)。与BDNF不同的是,TrkB的蛋白水平随培养脑片的逐渐成熟不断上调,从培养第二天开始即有显著性升高(P<0.05,n=4)。在海马脑片培养中,随时间依赖的BDNF和TrkB表达的动态演变提示BDNF-TrkB的信号强度在神经元成熟过程中有动态调节过程。随后,我们探讨了上调BDNF信号强度对神经再生的影响是否与神经元成熟有关。内源性的BDNF和TrkB表达水平的变化可能影响外源性BDNF的促神经再生作用。正如前面实验证实,在培养期间,内源性的BDNF和TrkB表达水平呈现一定的特征性改变。我们推测,外源性BDNF的补充需要一定的时机选择。根据海马脑片培养期间内源性的BDNF和TrkB表达特征,我们将脑片培养分为培养早期(DIV0-8)和培养后期(DIV9-16),2个时期内均有外源性BDNF补充,分别比较外源性BDNF在不同时间段补充对新生神经元的促进作用。在第16天(DIV 16)计数BrdU+/DCX+细胞,结果显示在培养后期给予外源性BDNF并未显著促进神经再生。然而在培养早期给予相同剂量的外源性BDNF,BrdU+/DCX+细胞数量显著增多(与对照组相比,P<0.05,n=5),具有显著的促神经再生的效应。在培养早期补充BDNF组新生神经元的平均数量与前16天全程持续补充BDNF组的新生神经元平均数相似。早期补充BDNF与晚期补充所致的神经发生数量有显著差异(P<0.05,n=5)。结合内源性的BDNF和TrkB表达特征,结果提示外源性BDNF的补充与内源性的BDNF和TrkB表达水平有关,适度的BDNF-TrkB信号强度可能是神经元再生的重要影响因素。4海马脑片培养氧糖剥夺(OGD)模型诱导新生神经元的产生尽管既往报道在海马脑片培养中氧糖剥夺(OGD)可诱导新生神经元的产生,然而我们第一章研究结果发现海马脑片培养本身有一定数量的新生神经元。因此,在OGD处理后鉴定的新生神经元可能是与脑片培养本身有关。为了进一步证实OGD可诱导或促进新生神经元的生成,本研究设计4个实验组：对照组1,BrdU处理时间在培养前3天(DIV0-3)；对照组2,给予两次BrdU,分别在DIV0-3及DIV8-11；OGD处理1组,在对照组1的基础上于DIV8给予氧糖剥夺；OGD处理2组,在对照组2的基础上于DIV8给予氧糖剥夺(图2-1a)。在海马脑片培养DIV16用DCX与BrdU抗体进行荧光双标记,对DCX+/BrdU+细胞(新生神经元)计数。如图2-1b所示,在OGD处理前给予BrdU仅能标记脑片培养过程中自发发生的新生神经元,OGD 1组与对照组1并无显著差异,提示OGD处理对自发发生的新生神经元的存活和分化影响不显著。在OGD处理后给予BrdU能标记在OGD发生后发生增殖的神经祖细胞。比较OGD 2组和对照组2,可见DCX+/BrdU+细胞数有显著差异(P<0.05),OGD处理可增高新生神经元的数量。同样,OGD 2组的DCX+/BrdU+细胞数显著高于OGD 1组,提示OGD处理可能主要通过诱导神经祖细胞增殖。5新生神经元的产生依赖于海马脑片培养氧糖剥夺(OGD)损伤程度上述结果显示OGD可能通过诱导神经祖细胞的增殖促进新生神经元的产生。我们推测,神经元的受损程度可能与OGD的诱导增殖能力有关。因此,实验中设计三种OGD处理时间,以文献报道的OGD处理时间定义为1)常规OGD组,OGD持续时间50分钟；2)轻度OGD处理组,处理时间为常规时间的一半,25分钟；3)重度OGD组,OGD持续时间100分钟。在DIV 9,即OGD处理后1天给予PI染色鉴定培养脑片的细胞损伤程度。结果显示,细胞损伤水平与OGD处理时间成正相关。在培养前三天用BrdU处理的脑片中,在OGD处理后立即检查BrdU+细胞,可测定OGD诱导的细胞增殖和神经再生。以对照组2的BrdU给予方法,比较三种OGD处理时间对培养的海马脑片新生神经元生成的影响。结果显示,轻度OGD和常规OGD组显著增加DCX+/BrdU+细胞数,显著提高海马脑片培养的新生神经元生成(P<0.05,n=5)。常规OGD组诱导的新生神经元数量比轻度OGD组显著增高,严重OGD组诱导产生的新生神经元较其它组都少,与轻度OGD组和常规OGD组相比、甚至与对照组相比均有统计学差异(P<0.05, n=5,ANOVA and post-hoc LSD test),严重OGD组的反向作用原因可能是严重的缺氧导致培养脑片的神经祖细胞或新生的神经元死亡,最终表现为在DIV16检测的新生神经元数量较少。6海马脑片培养OGD损伤后BDNF与TrkB的表达变化前面已经证明,内源性BDNF及TrkB的蛋白表达是随着体外海马脑片培养的时间动态变化的。在脑片培养的过程中,神经元生长经历了不同的过程,包括损伤、修复、神经元的再生与成熟过程等,这些过程可能与BDNF-TrkB信号强度相互关联。而OGD的损伤后,内源性BDNF及TrkB的蛋白表达又是如何变化的?本研究利用Western blot的方法测定OGD处理后不同培养时间点的BDNF与TrkB的相对表达水平。以未受OGD处理的脑片(DIV 8)为对照,结果发现TrkB和BDNF蛋白表达改变相匹配,在OGD早期急剧下调,在OGD后期急速回升。BDNF在24小时和48小时显著低于对照组(P<0.05),随后快速回升,并在OGD处理6天后和8天后(DIV 14和DIV 16)显著高于对照组(P<0.05)。TrkB则在OGD处理48小时后的表达显著降低,而在OGD处理后8天显著高于对照组。与同时期的正常脑片培养相比,BDNF及TrkB蛋白的表达在OGD处理后4天并未有显著差异,而在OGD处理后OGD处理后8天显著增高(P<0.05)。结果提示,OGD诱发细胞损伤后的早期(4天内),BDNF及TrkB蛋白的表达下调；在损伤修复期(6-8天),与未受OGD处理的同时期脑片相比,BDNF及TrkB蛋白的表达显著增高,证明OGD处理本身可促进BDNF及TrkB蛋白的表达。结论1.海马脑片培养是研究神经再生的一个重要工具。2.外源性补充BDNF可成浓度依赖地促进海马脑片培养的新生神经元生成。3.阻断内源性或外源性的BDNF均可抑制海马脑片培养的新生神经元生成。4.海马脑片培养过程中内源性BDNF与TrkB蛋白表达是动态变化的。在培养早期,内源性BDNF相对不足。5.外源性补充BDNF的促神经再生作用具有时机性。在培养早期给予外源性BDNF补充最为关键,可能与培养早期的内源性BDNF相对不足有关。6.在海马脑片中给缺氧缺糖处理后,细胞存在不同程度的损伤, 并在损伤后的修复期新生神经元增加。7.培养的海马脑片给予不同维持时间的缺氧处理,细胞损伤水平与处理时间成正相关。细胞损伤较小时,诱导生成的新生神经元数量也较小。细胞损伤过大,培养的海马脑片的新生神经元数量并未相应增高,相反,显著低于正常对照。8.在培养的海马脑片中,缺氧处理后的细胞损伤早期内源性BDNF与TrkB的表达水平显著下降；而在缺氧处理后期,即细胞修复期,内源性BDNF与TrkB的表达水平迅速增高,并在缺氧处理后8天,显著高于正常对照。