【摘 要】
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通过纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓分析相结合的方法,成功地从环境中筛选到一株纤溶活性较高的细菌菌株。利用细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研
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通过纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓分析相结合的方法,成功地从环境中筛选到一株纤溶活性较高的细菌菌株。利用细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符。根据细菌16S rDNA的保守序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出该菌的16S rDNA片段,对该序列克隆后测序,并与已报道的序列进行比对,结果表明:它与藤黄微球菌的16S rDNA序列的同源性高达99%。此结果进一步表明,该菌在系统分类学上属于微球菌属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus),将其命名为ML-909。 根据解淀粉芽孢杆菌的豆豉溶栓酶(DFE)全基因、前肽-成熟肽(proDFE)序列、成熟肽编码序列设计3对引物,以ML-909菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,扩增结果表明,从ML-909 DNA中扩增出编码成熟肽的DNA片段。测序结果显示,该片段大小为828bp,与豆豉溶栓酶(DFE)成熟肽基因片段大小完全相同,同源性达到99%,仅有2个碱基的差异,并导致1个氨基酸的变异。该序列编码由275个氨基酸残基组成的酶蛋白,命名为藤黄微球菌溶栓酶(MLFE)。 为了进一步探讨溶栓酶基因的异源表达特性,根据豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端编码序列分别设计2对引物,并在引物N-端和C-端分别引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列,分别以解淀粉芽孢杆菌及藤黄微球菌基因组DNA为模板,扩增出豆豉溶栓酶的前肽.成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽编码区(828bp)。扩增产物克隆到pMD18-T载体中,所获重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,将其克隆到大肠杆菌高效表达质粒pMAL-p2X中,构建溶栓酶基因-麦芽糖结合蛋白基因相融合的表达质粒pMAL-pDFE及
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