论文部分内容阅读
目的迄今为止，慢粒白血病急变期（CML-BC）患者缺乏有效的临床治疗策略。在诸多研究中已证明，CML-BC细胞内大量ROS激活Nrf2-ARE信号通路，刺激NADPH脱氢酶醌1（NQO1）、血红素氧合酶1（HO1）等受上游ARE元件调控的基因转录。Pizzatti等人发现SUZ12基因过表达与CML-BC疾病进展高度相关，CML-BC病人的外周血以及骨髓CD34+单核细胞中SUZ12基因启动子活性显著升高。故本课题设计腺病毒介导的ARE/SUZ12双重特异性调控自杀基因体系，旨在探讨其对慢性粒细胞白血病急变期细胞株的杀伤效应。方法（1）基于生物信息学数据库以及启动子序列本身特点，利用片段缺失法设计SUZ12基因上游启动子片段，通过荧光素酶报告基因实验比较各片段的启动活性。构建pAdtrack-ARE/SUZ-TK以及pAdtrack-ARE/SUZ-Luc穿梭质粒，通过BJ5183感受态将穿梭质粒重组入pAdEasy系统，在293细胞内包装重组腺病毒。（2）将Ad-ARE/SUZ12-Luc、Ad-SUZ12-Luc、Ad-control重组腺病毒感染慢性粒细胞白血病急变期K562、K562-G01、KCL22细胞株和HepG2对照细胞株，通过荧光素酶报告基因实验比较ARE/SUZ12复合启动元件的启动活性；通过CCK8、瑞氏染色、流式检测等方法检测ARE/SUZ12双重调控自杀基因体系对于人源慢粒急变期细胞的杀伤作用。结果（1）在SUZ12基因上游设计的S1、S2、S3三段序列中，S1具有较强的启动活性。构建含有S1启动子的pAdtrack-ARE/SUZ-TK以及pAdtrack-ARE/SUZ-Luc等穿梭质粒,并在BJ5183内实现成功重组入pAdEasy系统，最终包装成复制缺陷型腺病毒。（2）重组腺病毒Ad-ARE/SUZ12-Luc、 Ad-SUZ12-Luc、 Ad-control感染K562、K562-G01、KCL22细胞后，与对照组相比，ARE/SUZ12复合元件具有相对特异且更强的启动活性。重组腺病毒Ad-ARE/SUZ12-TK、Ad-SUZ12-TK、Ad-control感染K562、K562-G01、KCL22细胞后，与对照组相比，ARE/SUZ12复合元件所调控的TK/GCV系统能显著抑制CML-BC细胞增殖及诱导细胞凋亡。结论实验结果显示，ARE元件与SUZ12启动子联合启用成功地发挥了协同效应，ARE/SUZ12双重调控自杀基因系统能有效且特异地对CML-BC细胞产生杀伤效应。