本课题包括对粘膜免疫相关新基因TIG-310和粘膜抗原提呈分子小鼠CD1d的研究。 本实验室在分析研究Ty21a免疫小鼠前后肠粘膜差异表达的基因时，发现了数条在Ty21a免疫后表达量发生改变的新表达序列标签(Expression Sequence Tag,ESTs)，为了深入研究相应新基因在粘膜免疫中的作用，我们采用了RACE-PCR技术以扩增这些ESTs所对应的基因全长。其中扩增得到了EST310的全长基因(TIG-310)。分析表明该基因序列与GenBank中的一条序列仅存在一处碱基突变，但未见该基因相关的功能报导。我们查询了该基因与其它基因的同源性，基因的ORF、电子表达谱和在染色体上的定位及其编码蛋白的信息。该基因位于小鼠的第11对染色体，含有一个ORF，编码的蛋白由267个氨基酸组成，可能表达于胃肠粘膜部位。 为了研究TIG-310是否与粘膜免疫相关，我们利用pQE30原核表达系统，获得TIG-310基因在M15受体菌株中的高效表达。利用RT-PCR技术分析了该基因在正常Balb／c小鼠脑、心脏、胸腺、肺、胃、肾、肠、肝、脾、PP结、MLN、子宫等12种组织的表达情况，发现该基因高表达于胃肠粘膜部位，在PP结上有较弱表达。由于肠粘膜含有多种细胞，其功能又各不相同，我们用原位杂交方法分析肠粘膜中表达TIG-310的细胞，发现该基因主要表达在肠粘膜的上皮细胞。将TIG-310的编码区与绿色荧光蛋白进行融合，分别转染小鼠成纤维细胞系L细胞和人COS-7细胞，筛选G418抗性克隆，在共聚焦显微镜和荧光显微镜下观察荧光蛋白的细胞定位，发现融合蛋白主要定位在细胞浆，但有的细胞也存在全细胞荧光分布。由以上结果我们可以推测，TIG-310主要表达在正常Balb／c小鼠小肠上皮细胞的胞浆。 由于Ty21a灌胃免疫后TIG-310在小肠细胞的表达发生改变，因此，我们利用RT-PCR系统检测了Ty21a每次免疫后第二、第五天该分子在胃、肠和PP结的表达情况。发现1．首次免疫后，胃肠粘膜与PP结中TIG-310表达均有显著性增高，且胃肠增高比PP更为明显；2．随免疫次数增加TIG-310的表达逐次逐天下降，均低于正常组。将纯化的pEGFP-310质粒注入小鼠的股四头肌，发现该重组质粒可促进大量炎性细胞向注入部位聚集，用RT-PCR检测注入局部14种炎性相关细胞浮目卜斑气丈因子的表达，发现重组质粒可使局部IFN一丫和IL一12p40的表达明显上调。说明该基因可能通过影响IFN一:和IL一12p40的表达，从而促进免疫局部的炎性反应。由于TIG一310主要表达在粘膜上皮细胞，并在初次免疫后显著上调，含有该基因的重组质粒可刺激肌注局部炎性细胞聚集及IFN一丫和IL一12p40细胞因子的表达上调，推测TIG一310可能与维持粘膜上皮细胞的正常功能或自然防御机制相关。 tetramer标记是一种新建立的可对抗原特异的T细胞进行鉴定的技术。NKT细胞是一群新近发现的具有免疫调节功能的细胞。在本实验中，我们尝试制备mCD 1 dtetramer，以标记CDI分子限制的NKT细胞，研究这群细胞在粘膜免疫中的作用。我们选用的表达系统是昆虫杆状表达系统。将mCDld和pZm先后连入穿梭质粒pFastBac Dual，获得重组质粒pBD一CDI一pZm;在DHlobae菌株中通过同源重组，将eD一和pZm整合到Bacmid基因组;重组Bacmid通过Cellfeetin转染Sf-9细胞，并在Sf-9细胞中包装成病毒颗粒。利用SDS一PAGE检测目的蛋白的表达。载体构建成功，但未获得蛋白表达。 为观察CDI分子是否对不同来源的淋巴细胞具有刺激活性，将表达mCDld的CHO细胞分别与从脾、肝、胸腺、PP和MLN等不同部位新分离的淋巴细胞进行共育，7天后利用MTT法检测淋巴细胞增殖，并用流式细胞术检测培养体系中NKI.1和CD3双阳性淋巴细胞的比例，结果发现表达mCDld的CHO细胞可刺激肝内和中心淋巴结的淋巴细胞发生增殖，并使CD3十细胞中NKI.1阳性细胞的比例增加。