论文部分内容阅读
多重基因表达分析是从转录水平上筛选、明确功能基因的有效方式。目前,表达分析技术包括高通量、低准确率的cDNA芯片与高精度、低通量的real-time qPCR技术,尚缺乏中等通量（10～30）、较高精度的表达监控体系。本文建立并优化了一种基于荧光通用引物的中等通量多重定量RT-PCR技术。该技术采用了嵌合特异引物引导荧光通用引物扩增的方案,前几个循环嵌合特异引物使目的基因待扩序列的两端加上了通用引物序列,在接下来的循环过程高浓度的通用引物取代了嵌合特异引物完成整个PCR反应。从多对嵌合特异引物的PCR反应转变为一对通用引物的PCR反应大大降低了PCR反应的复杂性,并且所有待扩目的基因片段也在一对通用引物的作用下被等比例的扩增,从而实现多重定量检测。该技术实现了经济可靠的中通量基因表达定量研究,弥补了基因表达分析平台中cDNA芯片定量准确性低和real-time qPCR通量小的缺点,完善了整个基因表达的分析过程。前期的研究通过全基因组扫描和特异区段同类系分析发现在小鼠的X染色体上存在一个与小鼠性发育启动时间相关的QTL区段,本研究以该QTL区段为例,选择了11个目的基因进行了技术构建及优化,包括以下三方面的内容:引物序列设计、逆转录反应体系和多重PCR反应系统。引物序列设计上完成了通用引物和包括看家基因在内的14对基因嵌合特异引物的序列设计;逆转录反应体系的研发过程中,主要考察了下游嵌合特异引物的量,逆转录延伸时间;多重PCR体系的研发过程中,主要考察了通用引物与上游嵌合特异引物的用量比,PCR反应程序优化(Mg2+浓度、退火时间、延伸时间等),降落式（Touchdown,TD）PCR结合通用引物补加方案和最低模板检测灵敏度等。实验结果表明,该技术的检测灵敏度为102拷贝,通用引物与上游嵌合特异引物的比例以1:1为佳,并且验证了该技术的重复性和准确性。降落式（Touchdown）PCR结合通用引物补加实验表明,该优化步骤可大大改善低丰度表达基因的扩增。通过对2个品系（C3H/HeJ和C57BL/6J）15日龄小鼠的下丘脑和睾丸组织中的11个基因的表达分析,在下丘脑中找到了一个差异表达的基因PHF6可用于进一步的基因功能研究。