研究背景和目的：脓毒症是临床最古老又最难避免的疾病之一，尽管新的治疗药物和手段不断涌现，但其死亡率却始终高居不下。因此进一步阐述其病理生理机制，寻找新的、更特异性的药物作用靶点显得尤为重要。脓毒症血管低反应性的发生是导致难治性低血压的发生和高死亡率的重要原因。对于血管低反应性的发生机制目前认为主要与血管舒缩相关受体失敏；钾离子通道的激活引起血管平滑肌细胞膜的超极化，以及本实验室提出的血管平滑肌细胞(VSMC)钙失敏学说(力/钙比下降)有关。作为脓毒症时机体产生的重要细胞因子，体、内外研究均证实IL-1β参与了脓毒症血管低反应性的发生，而对于其介导作用机制，目前认为有ΝΟ依赖性作用机制：诱导型NO合酶(iNOS)活性增高，导致ΝΟ产生增加，引起VSMC舒张；ΝΟ非依赖性作用机制：血管舒缩相关受体失敏和钾离子通道的激活使VSMC膜超极化。但是针对上述机制的治疗只能部分恢复血管反应性，提示存在着其它作用机制或具有较目前更特异的作用靶点。鉴于α1肾上腺素能受体(α1ARs)在心血管系统中的重要作用以及在感染、创伤、休克等应激反应中的重要地位。IL-1β对脓毒症VSMCα1ARs失敏(即对其特异激动剂所引起的血管收缩能力下降，受表达量和亲和力影响)作用明确。进一步研究发现IL-1β对α1ARs亲和力无明显作用，但能降低血管α1ARs的表达，但对其调控机制却不甚清楚。α1ARs包含有α1A，α1B，α1DAR三个亚型，它们的分布、表达量和表达调控机制具有种属和组织差异性。多种研究提示IL-1β调节基因表达的信号通路主要有：NF-κB，p38MAPK和JNK通路，另外ERK，JAK-STAT通路也可发挥作用。鉴于α1ARs的表达调控机制具有种属和组织差异性，对于不同种属的调控信号通路是否一致，目前并不清楚。另外IL-1β对基因的表达调控有转录和转录后水平差异，那么IL-1β对α1ARs*基金项目：国家自然基金重点(3080053)，973项目（2005CB522601）和国家杰出青年基金（30625037）的表达调控是通过什么水平的呢？目前并未阐明。目前大鼠VSMC的α1ARs各亚型的启动子区域均已克隆出来，且主要调控各亚型启动子活性的转录因子也已知道。鉴于IL-1β对α1ARs各亚型的表达在同一细胞(VSMC)中均有相同的下调作用，我们推测可能通过相同的转录因子发挥作用，而相同的转录因子只有Sp1和AP2。假如推测成立的话，那么信号通路与转录因子间的关系如何呢？是否有调控作用呢？也应进行有益的探索。钙失敏假说，其发生机制与PKC，Rho激酶等的活性下降，激酶抑制肌球蛋白轻链磷酸酯酶(MLCP)活性的能力下降，导致肌肉收缩相关蛋白20kD肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化水平降低有关。在同浓度[Ca2+]作用下，引起的收缩力要相对弱些。相对于其它激酶，Rho激酶在其中地位比较突出。基础研究显示Rho激酶活性受RhoA的调控，RhoA又主要受RhoGEFs调控，而RhoGEFs的活性又受Gαq/11和Gα12/13的调节。VSMCs主要存在的RhoGEF家族成员有：p115RhoGEF，PDZ-RhoGEF，LARG和p63RhoGEF。Gα12/13调节p115RhoGEF，PDZ-RhoGEF，LARG的活性，而Gαq/11调节p63RhoGEF和LARG的活性。那么究竟IL-1β是否介导脓毒症血管的钙失敏发生呢？如果是的话，它又是通过调节哪个或哪几个G蛋白的活性进而引起相应的RhoGEF活性改变来调控RhoA活性，进而调控Rho激酶活性及MLC20磷酸化水平而导致血管钙失敏的呢？目前尚不清楚。本研究利用LPS诱导的家兔脓毒症和盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的大鼠脓毒症模型，以及体外用IL-1β孵育SMAs和VSMCs的方法，运用多种生理和分子生物学技术，观察IL-1β对不同种属(大鼠和家兔)和不同诱导方法所致的脓毒症动物模型血管低反应性的α1ARs和钙敏感性的介导作用，及其可能调控机制，以期更深入阐述脓毒症血管功能障碍的发病机制，为脓毒症的治疗寻找新的特异性靶点。方法：第一部分：明确IL-1β在脓毒症血管α1肾上腺素能受体失敏和钙失敏中的作用1. IL-1β对脓毒症家兔血管钙和α1肾上腺素能受体敏感性的作用(1)通过LPS静脉注射复制家兔脓毒症模型，检测不同时相点SMAs的α1ARs敏感性，钙敏感性，α1ARs表达水平及血清IL-1β浓度，并分析脓毒症产生的IL-1β与血管α1ARs敏感性，钙敏感性和α1ARs表达水平变化的相关性。(2)用IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)静注脓毒症家兔，观察其对血管α1ARs和钙敏感性及α1ARs表达的影响，在整体动物水平验证IL-1β对血管α1ARs和钙敏感性及α1ARs表达的作用。(3)体外用不同浓度IL-1β孵育家兔SMAs，检测SMAs的α1ARs和钙敏感性及α1ARs表达水平。在离体动物水平观察IL-1β对SMAs的α1ARs和钙敏感性及α1ARs表达水平的作用。2. IL-1β对脓毒症大鼠血管钙和α1肾上腺素能受体敏感性的作用(1)通过盲肠结扎穿孔(CLP)方法复制脓毒症大鼠模型，检测不同时相点大鼠SMAs的α1ARs敏感性，钙敏感性，α1ARs表达水平及血浆IL-1β浓度，并分析脓毒症产生的IL-1β与血管α1ARs敏感性，钙敏感性和α1ARs表达水平变化的相关性。(2)采用组织块贴壁法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用不同浓度(0，1，10，100ng/ml)重组IL-1β孵育平滑肌细胞，在离体水平观察IL-1β对VSMCα1ARs的表达和MLC20磷酸化水平的影响(分别代表α1ARs和钙敏感性)。第二部分：探索IL-1β介导脓毒症血管钙失敏的机制1. IL-1β介导家兔血管钙失敏机制的探索1)应用PKC、Rho激酶激动剂、拮抗剂处理SMAs，观察PKC，Rho激酶在IL-1β介导的钙敏感性改变中的作用。2)观察IL-1β对SMAs反映钙敏感性的检测指标：MLC20的磷酸化水平的影响3)观察IL-1β对SMAs PKC、Rho激酶活性的影响。2. IL-1β介导大鼠血管钙失敏机制的探索1)检测IL-1β对VSMCs的Rho激酶活性的影响。2)检测IL-1β对VSMCs的Gα11、Gαq、Gα12、Gα13表达水平的影响。3)检测IL-1β对VSMCs的总RhoGEF及PDZ-RhoGEF和p63-RhoGEF活性的影响。4)联合运用NF-κB，p38MAPK, JNK通路特异性抑制剂，观察NF-κB，p38MAPK,JNK通路特异性抑制剂对Gα11和Gα12表达水平的影响。5)观察IL-1β对VSMCs的AP2α表达水平的影响；运用AP2αsiRNA观察AP2α对Gα12表达水平的影响。第三部分：探索IL-1β介导脓毒症血管α1肾上腺素能受体失敏的机制1. IL-1β介导家兔血管α1ARs失敏机制的探索1)IL-1β联合JAK2-STAT3通路抑制剂孵育家兔SMAs，观察JAK2-STAT3通路在IL-1β介导的SMAsα1ARs表达调控中的作用，以及对α1ARs敏感性的影响。2)观察IL-1β对SMAs STAT3的DNA结合能力的影响。2. IL-1β介导大鼠血管α1ARs失敏机制的探索1)联合运用JNK，p38MAPK, NF-κB通路抑制剂，观察各通路抑制剂在IL-1β介导的VSMCsα1ARs表达调控中的作用2)联合运用放线菌素D，观察IL-1β对α1ARs mRNA半衰期的影响。3)克隆α1DAR启动子，并构建双萤光素酶标记质粒，转染VSMCs，观察IL-1β对α1DAR启动子活性的影响。4)检测IL-1β对转录因子Sp1，Sp3，AP2，NF-κB p50，NF-κB p65表达水平、DNA结合能力的影响，以及转录因子在IL-1β介导的α1ARs表达调控中的作用。5)观察JNK，p38MAPK, NF-κB信号通路与转录因子间的相互作用关系：信号通路对转录因子表达和DNA结合能力的影响结果：第一部分．IL-1β通过诱导α1肾上腺素能受体失敏和钙失敏介导脓毒症血管低反应性的发生(一)IL-1β介导脓毒症家兔血管α1肾上腺素能受体和钙失敏的发生1.脓毒症家兔SMAs的钙敏感性，α1ARs敏感性和各亚型α1ARs的表达呈时间依赖性降低，而家兔血清IL-1β水平在给LPS后4h明显升高。相关性分析显示给LPS后4h血浆IL-1β水平与血管α1ARs和钙敏感性及α1ARs表达水平的变化存在显著负相关。同时IL-1ra能明显改善血管的钙和α1ARs敏感性及α1ARs表达水平。整体实验提示：IL-1β介导脓毒症血管钙失敏和α1ARs失敏。2. IL-1β能明显降低离体SMAs的钙和α1ARs敏感性，以及α1ARs表达水平。离体实验进一步证实：IL-1β能介导血管钙失敏和α1ARs失敏的发生。(二)IL-1β介导脓毒症大鼠血管α1肾上腺素能受体和钙失敏的发生1.脓毒症大鼠SMAs SMAs的钙和α1ARs敏感性及α1ARs的表达均明显降低，而血浆IL-1β水平却明显升高，与同时期SMAs的钙和α1ARs敏感性及各亚型α1ARs的蛋白水平呈明显负相关。整体实验提示：IL-1β可能介导脓毒症血管钙失敏和α1ARs失敏。2. IL-1β能明显降低血管平滑肌细胞的MLC20磷酸化水平和各亚型α1ARs的蛋白水平，这两指标间接反应钙和α1ARs敏感性。离体实验证实：IL-1β能介导血管钙失敏和α1ARs失敏的发生。第二部分．IL-1β调节脓毒症血管钙失敏的可能机制(一)IL-1β介导家兔脓毒症血管钙失敏的可能机制1. PKC、Rho激酶激动剂能明显改善IL-1β孵育血管的钙敏感性，Rho激酶特异抑制剂能明显进一步降低IL-1β孵育血管的钙敏感性，但PKC的特异抑制剂却不能明显改变其钙敏感性。提示：PKC、Rho激酶都可能参与IL-1β介导的血管钙失敏作用。2. IL-1β能明显降低离体SMAs的MLC20磷酸化水平。提示：IL-1β是通过下调MLC20磷酸化水平介导血管钙失敏的。3. IL-1β能明显降低离体SMAs的PKC、Rho激酶活性。提示：IL-1β能通过下调PKC、Rho激酶活性介导血管钙失敏的。(二)IL-1β介导大鼠脓毒症血管钙失敏的可能机制1.IL-1β能明显降低大鼠VSMCs的Rho激酶活性。提示：Rho激酶在IL-1β介导大鼠脓毒症血管钙失敏机制中的作用。2.IL-1β能明显提高VSMCs的Gα11表达水平，但却明显降低Gα12表达水平，而对Gαq和Gα13表达水平无明显改变。提示：IL-1β对介导钙敏感性调节的G蛋白存在差异表达调节。3.IL-1β能明显提高VSMCs的p63RhoGEF活性，却明显降低VSMCs的总RhoGEF和PDZ-RhoGEF活性。提示：RhoGEF活性与其上游G蛋白的表达变化方向一致，得出G蛋白表达水平与活性变化方向一致；由于总RhoGEF活性下降，得出Gα12介导的RhoGEF活性变化作用可能强于Gα11介导的RhoGEF活性变化作用。4.运用NF-κB，p38MAPK和JNK抑制剂，得出NF-κB抑制剂组能明显降低IL-1β调节的VSMCs的Gα11表达水平，但p38MAPK或JNK抑制剂不能明显改变Gα11表达水平，NF-κB或p38MAPK或JNK抑制剂均不能明显改变Gα12表达水平。提示：IL-1β调节基因表达的主要信号通路中，只NF-κB对Gα11表达有正向调节作用。5.IL-1β明显降低VSMCs的转录因子AP2α表达水平。RNA干扰结果显示AP2α对Gα12表达有正向调节作用。结果提示：IL-1β能通过下调AP2α表达水平介导VSMCGα12表达下调。第三部分IL-1β介导脓毒症血管α1肾上腺素能受体失敏的可能机制(一)IL-1β介导脓毒症家兔血管α1肾上腺素能受体失敏的可能机制1.通过运用JAK2-STAT3通路抑制剂(AG490)，发现其能明显升高IL-1β处理SMAs的α1ARs表达水平以及α1ARs敏感性。提示JAK2-STAT3通路可能参与了IL-1β调节α1ARs的表达。2.IL-1β能明显升高STAT3的DNA结合能力，AG490和未生物素标记的STAT3共有序列探针(竞争性探针)均能明显降低STAT3的DNA结合能力。提示：IL-1β调节血管α1ARs的表达可能通过转录因子STAT3发挥作用。(二)IL-1β介导脓毒症大鼠血管α1肾上腺素能受体的可能机制1. NF-κB通路抑制剂能明显增加IL-1β处理的大鼠VSMCs各亚型α1ARs的表达，但JNK或p38MAPK通路抑制剂却不能明显改变各亚型α1ARs的表达。提示：NF-κB通路在IL-1β调节VSMCsα1ARs表达中的重要作用。2. IL-1β对大鼠VSMCs各亚型α1ARs的mRNA半衰期无明显作用。但IL-1β明显降低大鼠VSMCsα1DAR启动子活性。提示：IL-1β不是通过转录后影响大鼠VSMCsα1ARs mRNA稳定性而是在转录水平调节α1ARs表达的。3. IL-1β能明显降低Sp1和AP2的表达水平以及DNA结合能力，运用RNA干扰技术，结果显示Sp1和AP2都对大鼠VSMC各亚型α1ARs的表达水平呈正向调节。但对Sp3蛋白表达水平无明显改变。提示：IL-1β可能通过下调Sp1和AP2的表达水平介导大鼠VSMC各亚型α1ARs的表达下调；Sp1的活性不受Sp3调节。4. IL-1β能明显升高NF-κB p50和NF-κB p65蛋白表达水平，且IL-1β能明显升高NF-κB的DNA结合能力，RNA干扰实验结果提示NF-κB对大鼠VSMC各亚型α1ARs的表达水平呈负向调节。结果进一步证实NF-κB通路在IL-1β介导VSMCsα1ARs表达中的重要作用。5. JNK，p38MAPK，NF-κB通路与Sp1和AP2的关系：1)各通路抑制剂对IL-1β处理的VSMCs Sp1和AP2的表达无明显作用；2)NF-κBp65siRNA能明显增加IL-1β处理的VSMCs Sp1和AP2的DNA结合能力；3)免疫沉淀结果显示：IL-1β能明显增强NF-κB p50与NF-κB p65，Sp1或AP2的结合能力，但NF-κB p65与Sp1或AP2间，以及Sp1与AP2之间相互作用关系结果均为阴性。结果提示：NF-κB通路不是通过改变Sp1和AP2的表达而是降低Sp1和AP2的DNA结合能力来参与IL-1β介导的VSMCsα1ARs表达的。结论：1. IL-1β可通过下调血管的α1肾上腺素能受体敏感性和钙敏感性介导脓毒症血管低反应性的发生。2.IL-1β可通过下调PKC、Rho激酶的活性及MLC20的磷酸化水平介导脓毒症血管钙敏感性降低。进一步研究发现IL-1β一方面通过下调AP2α水平使Gα12表达下降，下调PDZ-RhoGEF活性；另一方面通过NF-κB途径上调Gα11表达，上调p63RhoGEF活性，两方面途径的总效用是使总RhoGEF活性下降，进而使Rho激酶活性以及MLC20磷酸化水平下降而介导脓毒症血管钙失敏的发生。3.IL-1β可通过激活JAK2-STAT3信号通路，提高STAT3与α1ARs启动子区域的DNA结合能力，下调α1ARs的表达介导脓毒症血管α1ARs失敏。4. IL-1β可一方面通过激活NF-κB信号通路，增加NF-κB与转录因子Sp1和AP2的相互作用，另一方面下调Sp1和AP2的表达水平，两方面都下调Sp1和AP2与α1ARs启动子区域的DNA结合能力，在转录水平上下调α1ARs的表达介导脓毒症血管α1ARs失敏。