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研究背景肺部炎症反应过程中,构成微循环交换血管最内层的肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)是炎症因子首先攻击的效应细胞,其病理生理改变之一是细胞通透性增加,严重时可导致肺水肿,这是急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)的主要发病环节之一。多种信号转导通路参与PMVECs通透性调控,其中蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信号转导通路被广泛研究。已知活化的PKC磷酸化底物蛋白、促进PMVECs骨架重构以及细胞间黏附连接物解聚,从而增加PMVECs通透性,但细胞内PKC下游信号转导错综复杂,所以PKC底物及其在PMVECs通透性调控中的作用机制值得深入研究。此外,在人体研究PMVECs通透性变化十分困难,目前关于PMVECs通透性的研究结果主要来自体外细胞实验,所以PMVECs单层的融合状态决定实验结果精确性。src抑制的蛋白激酶C底物(src-suppressed C kinase substrate, SSeCKS)是一新发现的PKC底物,可被活化的PKC磷酸化。多种细胞株研究发现SSeCKS蛋白参与肌动蛋白骨架和血脑屏障的动态调控,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导大鼠PMVECs高表达SSeCKS蛋白,这些研究提示SSeCKS可能是PMVECs通透性调控的重要效应分子,但其在炎症因子如白介素(interleukin, IL)-1β和肿瘤坏死因子(tumor necrosin factor, TNF)-α诱导PMVECs通透性增加中的具体作用仍未阐明。除LPS外,其他在肺部炎症反应过程中发挥重要作用的炎症介质是否参与PMVECs中SSeCKS的诱导表达也未见报道。IL-17F是一种新的炎症因子,大量研究表明在支气管上皮细胞和静脉内皮细胞中,IL-17F通过诱导IL-6、IL-8和细胞间黏附分子-1表达触发一系列炎症反应;肺炎克雷伯杆菌、支原体或白色念珠菌感染后,肺部增加的IL-17F诱发中性粒细胞聚集和变态反应,这些研究提示IL-17F是参与肺部炎症反应的重要细胞因子。目前关于肺部IL-17F作用机制的研究主要集中在支气管上皮细胞,并且对其细胞内信号转导通路知之甚少,PMVECs是肺部炎症反应时的主要效应细胞,但关于IL-17F对PMVECs的刺激效应以及细胞内信号转导通路的研究却未见报道。目的观察PMVECs单层融合前后的生物学特征。融合PMVECs单层用于实验,观察IL-17F对PMVECs通透性的影响以及SSeCKS信号通路在IL-1β、TNF-α和IL-17F诱导PMVECs通透性变化中的作用,为认识ALI/ARDS发生机制提供实验依据。方法体外培养大鼠PMVECs;在Transwell和硝酸醋酸混合纤维膜上构建PMVECs单层;倒置显微镜、苏木素-伊红染色、跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance, TER)、异硫氰酸荧光素标记葡聚糖法(Pd)以及Hank’s平衡液法(LP)观察细胞单层生物学特征;逆转录聚合酶链反应分析SSeCKS的mRNA变化;免疫印迹技术分析PKC活性以及SSeCKS蛋白变化;应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽观察PMVECs肌动蛋白骨架改变;此外,PMVECs还被特异性的SSeCKS小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染。结果1)1×105/cm2的PMVECs接种Transwell后,TER随接种时间延长稳定升高,接种后第四天达最高,尔后维持,第十天TER开始下降,而倒置显微镜观察到细胞接种后第三天已融合成单层;2×105/cm2的PMVECs接种Transwell后,TER达高峰时间提前到接种后第二天,第九天TER开始下降;不同密度接种组的TER最高值间比较无显著性差异(P > 0.05)。静息状态下融合PMVECs单层TER为48.07±2.84 ?·cm2、Pd为6.19±0.43×10-6 cm/s、LP为6.80±0.62×10-7 cm/s/cm H2O。2)10mg/L LPS分别刺激融合PMVECs单层0.5h和2h后,与未处理对照组比较,TER显著下降、LP和Pd均显著增加。3)5ng/ml IL-1β和10ng/ml TNF-α分别激活PMVECs的PKC信号通路和诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达,IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS表达的效应更显著;BIM (1μmol/L,PKC抑制剂)显著下调PMVECs的PKC活性和抑制IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达,而蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)抑制剂(H89,10μmol/L)和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)抑制剂(金雀异黄素,50μg/ml)不影响IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达。4)与未处理组比较,50nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVECs 12h后,SSeCKS mRNA表达显著下降、24h达最低值、持续到转染后96h,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS蛋白表达的最佳时间在转染48h后,抑制率接近50%,抑制效应持续到转染后120h;SSeCKS-siRNA转染还以浓度依赖方式(10、20、50 nmol/L)沉默SSeCKS mRNA和蛋白表达。无论是脂质体空转染、普通阴性对照siRNA转染还是SSeCKS-siRNA转染均使融合PMVECs的静息状态TER轻微下降、静息状态Pd略升高,但与未处理组比较无显著性差异(P > 0.05)。5 ) IL-1β+TNF-α刺激显著下调PMVECs的TER和增加PMVECs的Pd ,SSeCKS-siRNA转染可显著下调IL-1β+TNF-α诱导细胞单层通透性的增加,但改善效果与BIM的改善效果比较存在差异(P < 0.05)。6)不同浓度IL-17F(0.1、1、10、100ng/ml)刺激PMVECs 3h后,下降的TER和增加的Pd与未处理组比较差异显著;100ng/ml IL-17F刺激细胞0.5h后,Pd与未处理组比较增加了15%、3~6h后Pd达高峰、显著增加的Pd持续到刺激后24h;同Pd变化,IL-17F刺激PMVECs单层时,TER呈时间依赖性下降;1、10μmol/L BIM均能改善IL-17F诱导增加的Pd和下降的TER,但都未能使其恢复到正常值。7)IL-17F刺激3h后,PMVECs的丝状肌动蛋白重组:从细胞周边向细胞中心转移并成平行束状堆积、增厚,同时细胞旁缝隙显著增大;流式细胞技术检测发现IL-17F刺激后,PMVECs中丝状肌动蛋白的相对荧光强度曲线向右位移、其平均荧光强度与未处理组比较显著增加,而1、10μmol/L BIM均能有效改善IL-17F诱导PMVECs肌动蛋白骨架的重构。8)不同浓度(0.1、1、10、100ng/ml)IL-17F刺激PMVECs后,SSeCKS的mRNA和蛋白表达均显著增加;100ng/ml IL-17F刺激PMVECs时,SSeCKS基因表达在刺激后3h达高峰,而蛋白表达在刺激后6h达高峰;IL-17F刺激PMVECs 5min后,SSeCKS蛋白的丝氨酸被磷酸化、30min后显著、3~6h后达高峰、后维持在较高的磷酸化水平至刺激后24h,而1μmol/L BIM预孵育后,IL-17F诱导增加的蛋白磷酸化水平显著下降;此外,IL-17F刺激PMVECs 30min后,不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白显著增加,3~6h后,不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白达高峰;最后,静息状态时,SSeCKS蛋白大部分集中在细胞质,IL-17F刺激30min后,细胞膜部SSeCKS蛋白的量与静息状态比较差异显著,刺激90min后,SSeCKS大部分集中在细胞膜。结论1)TER联合倒置显微镜较倒置显微镜单独应用能更准确判定PMVECs单层融合状态;2)TER、Pd、LP均能有效检测PMVECs单层通透性变化,TER联合Pd更多地反映PMVECs通透性变化信息;3)SSeCKS表达增加上调PMVECs通透性在ALI/ARDS复杂机制中占重要地位,IL-1β、TNF-α和IL-17F是PMVECs高表达SSeCKS基因和蛋白的强有力诱导剂,PKC而非PKA、PTK信号通路参与其表达调控;4)IL-17F通过激活PKC-SSeCKS信号转导通路以及诱导PKC依赖的F-actin骨架重构来增加PMVECs通透性,从而促进肺部炎症反应。