论文部分内容阅读
目的:1.建立体外小鼠骨髓间充质干细胞分别与泡状棘球蚴原头蚴和细粒棘球蚴原头蚴共培养体系,检测不同时间点各组BMSCsⅠ型胶原、Ⅲ型胶原表达情况,探讨两种棘球蚴原头蚴是否对BMSCs向成纤维细胞分化产生不同的影响。2.建立体外小鼠骨髓间充质干细胞分别与泡状棘球蚴原头蚴和细粒棘球蚴原头蚴共培养体系,检测不同时间点各组BMSCs TGF-β1、Smad7和磷酸化Smad2/3表达情况,探讨两种棘球蚴原头蚴是否通过TGF-β/Smad信号通路对小鼠骨髓间充质干细胞纤维化产生影响。3.期望阐明泡状棘球蚴病无法像细粒棘球蚴病形成纤维外囊壁的机制;为治疗泡状棘球蚴病的浸润性生长提供新的理论基础。方法:1.提取3-5周的C57BL/6小鼠下肢骨,利用贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞;体外培养传代纯化BMSCs,并诱导分化鉴定。2.分别从感染泡状棘球蚴的沙鼠体内提取泡状棘球蚴原头蚴;从感染细粒棘球蚴的羊肝中提取细粒棘球蚴原头蚴;染色鉴定活性。3.采用6孔板共培养原头蚴与小鼠BMSCs,根据实验设计分组:单纯对照组（BMSCs单独培养）;细粒棘球蚴组（细粒棘球蚴原头蚴和BMSCs共培养）;泡状棘球蚴组（泡状棘球蚴原头蚴和BMSCs共培养）。分别于培养后1、3、5、7天,收集细胞RNA、蛋白及细胞上清。采用实时荧光定量PCR检测各组BMSCsⅠ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平;Western blot检测各组BMSCsⅠ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达水平;ELISA检测各组细胞上清中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原浓度。4.分别将泡状棘球蚴原头蚴和细粒棘球蚴原头蚴与小鼠BMSCs共培养。单纯对照组（BMSCs单独培养）;泡状棘球蚴组（泡状棘球蚴原头蚴和BMSCs共培养）;细粒棘球蚴组（细粒棘球蚴原头蚴和BMSCs共培养）。分别于培养后1、3、5、7天,收集各组细胞RNA及蛋白。采用实时荧光定量PCR检测各组BMSCs TGF-β1和Smad7 mRNA表达水平;Western blot检测各组BMSCs Smad7和磷酸化Smad2/3蛋白表达水平。结果:1.成功分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过传代纯化,诱导鉴定成功。2.分别提取了泡状棘球蚴原头蚴和细粒棘球蚴原头蚴;经鉴定活性良好。3.在培养1、3、5、7天后,实时荧光定量PCR检测示,泡状棘球蚴组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量显著底于单纯对照组和细粒棘球蚴组;细粒棘球蚴组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著高于单纯对照组。Western blot检测示,泡状棘球蚴组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白相对表达量均显著底于单纯对照组和细粒棘球蚴组,细粒棘球蚴组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白相对表达量均显著高于其他二组。ELISA检测示,泡状棘球蚴组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量均显著底于单纯对照组和细粒棘球蚴组;细粒棘球蚴组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量均显著高于其他二组。上述指标三组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。4.在培养1、3、5、7天后,实时荧光定量PCR检测示,泡状棘球蚴组TGF-β1 mRNA相对表达量显著底于单纯对照组和细粒棘球蚴组,Smad7 mRNA相对表达量均高于其他组;细粒棘球蚴组TGF-β1 mRNA相对表达量均显著高于其他二组,Smad7 mRNA相对表达量均底于其他二组。Western blot检测示,泡状棘球蚴组磷酸化Smad2/3蛋白相对表达量均显著底于单纯对照组和细粒棘球蚴组,Smad7蛋白相对表达量均高于其他组;细粒棘球蚴组磷酸化Smad2/3蛋白相对表达量均显著高于其他二组,Smad7蛋白相对表达量均底于其他二组。上述指标三组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:1.泡状棘球蚴原头蚴可能通过TGF-β/smad信号通路,诱导BMSCs分泌Smad7,抑制分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1;抑制了BMSCs纤维化。可能与泡状棘球蚴病无法向细粒棘球蚴病一样形成纤维外囊壁有关。2.细粒棘球蚴原头蚴可能通过TGF-β/smad信号通路,促进了BMSCs分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1,促进了BMSCs纤维化,可能与细粒棘球蚴病形成纤维外囊壁有关。