论文部分内容阅读
研究目的:明确自身抗原TGM3参与AD自身变态反应发病的作用和机制研究内容:①TGMs的sIgE的水平及与特应性皮炎病情相关性研究;②AD患者皮损表皮中TGM的mRNA和TGM3蛋白的表达;③炎症刺激下的角质形成细胞的TGM的表达;④TGM3与CD209的体外结合实验;⑤TGM3对外周血单核细胞诱导的树突状细胞(MDDC)的活化能力研究;⑥TGM3对T细胞亚群分化的影响。研究方法:①联合使用免疫捕获法和生物素标记的酶联免疫分析法检测77例AD患者(包括44例青少年及成人、33例婴儿及儿童)、40例成人寻常性银屑病和30例成人健康对照者的血清中TGMs的sIgE的表达,并与病情进行相关性分析。②用qRT-PCR方法和激光共聚焦显微镜检测AD皮损表皮中的TGM基因mRNA的表达和TGM3蛋白的表达。③采用qRT-PCR方法检测炎症刺激状况下角质形成细胞中TGM的表达。④联用qRT-PCR方法和流式技术检测CD209siRNA后CD209的表达情况。采用ELISA方法和激光共聚焦显微镜和流式技术检测CD209与TGM3的结合能力。⑤用流式细胞仪和CBA小球分别检测TGM3刺激后的MDDC表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86 的表达情况和细胞上清中 IL-6、IL-1 β、IL-8、IL-10、TNF、IL-12p70的表达。⑥将初始T细胞与TGM3-MDDC共培养5天,用流式技术和CBA小球检测TGM3对T细胞亚群分化的影响及培养上清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A的表达。研究结果:①青少年及成人AD组、成人寻常性银屑病组TGMs的sIgE水平均显著高于成人健康对照组(χ 2值=37.12和15.88,P值均<0.001)。内源性AD组TGMs sIgE水平比外源性AD组升高(t=2.27,P=0.02)。AD患者组TGMs sIgE水平与患者年龄、病程、SCORAD评分、嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE无显著相关性(r=0.03,0.14,-0.04,-0.08 和 0.06,P=0.78,0.24,0.74,0.54 和 0.62)。②AD组皮损表皮中TGM3和TGM5的mRNA表达明显高于健康对照组(P=0.001和0.01)。AD患者皮损表皮中TGM3蛋白的表达水平比健康对照表皮明显升高。③ HaCaT 细胞培养上清中加入 Derp 10ug/ml,TSLP20ng/ml 刺激 12h、24h、36h后,TGM1表达均比空白对照组升高,差异有统计学意义(P值均<0.01)。加入IL-1β 1Ong/ml和50ng/ml刺激24h后,TGM1的表达比空白对照组升高,差异有统计学意义(P 值均<0.001)。在 Derp 10ug/ml 刺激 12h、36h 后,TSLP50ng/ml 刺激 24h和TSLP 20ng/ml刺激36h后,IL-1 β 50ng/ml刺激24h后,TGM2的表达均比空白对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.01)。在TSLP20ng/ml刺激12h后,Derp1Oug/ml 刺激 24h 和 36h 后,TSLP 50ng/ml 或 IL-1 β 50ng/ml 刺激 24h 后,TGM3的表达均比空白对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.001)。在derp 10ug/ml刺激 24h、36h,TSLP50ng/ml、IL-1 β 50ng/m L 刺激 24h,TSLP 20ng/ml 刺激 36h 后,TGM5的表达均比对照组的表达升高,差异有统计学意义(P均<0.001)。④CD209siRNA转染24小时后,CD209mRNA表达开始下降,CD209蛋白表达在72h时下降最明显。ELISA结果显示CD209可以与TGM3结合,激光共聚焦显微镜下及流式细胞仪检测显示TGM3可以被293T及MDDCs细胞上的CD209识别并结合摄取入细胞内,其结合能力可以被CD209阻断抗体及CD209siRNA部分阻断。⑤TGM3刺激24h后,MDDCs上的CD83、CD86分子及培养上清中炎症因子IL-6的表达水平与空白组、CD209抗体封闭组(a-CD209)比较有显著差异(CD83:P<0.001;CD86:P=0.007;IL-6:P=0.006)。⑥与空白组比较,TGM3—MDDCs-T细胞混合培养组的IFN-γ的表达升高,表达比率和MFI值均升高。与空白组比较,TGM3—MDDCs-T细胞混合培养组的TNF-α,IFN-γ分泌增加,差异有显著性(P=0.0018)。研究结论:①AD患者血清中TGMs sIgE 水平明显升高,TGMs可能是AD患者的一种内源性自身抗原。②AD患者皮损中TGM3的mRNA和蛋白表达均升高。③在一定的浓度 Derp、TSLP、IL-1 β 刺激下,HaCat 细胞的 TGM1、TGM2、TGM3、TGM5基因的表达均有不同程度的升高。④CD209 siRNA可有效降低CD209的mRNA和蛋白的表达。TGM3被CD209识别结合,并被介导摄取进入MDDC细胞内。⑤TGM3可刺激活化MDDC和促进IL-6表达升高。⑥TGM3—MDDCs可能诱导T细胞向Th1细胞亚群分化。