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目的：
1.在LSCC患者临床样本的肿瘤和癌旁组织中，观察PGE2,TNF-α,TNFR1,TRAF2,MMP-9,EP4和GRK2蛋白表达，揭示上述信号通路关键蛋白与LSCC临床分期及发生部位的关系；
2.在人LSCC细胞株Hep-2中，观察PGE2或/和TNF-α对Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用，EP4或TRAF2与GRK2的共表达，p-ERK的表达的影响及CP-25的作用，阐明TNF-α/TRAF2活化PGE2/GRK2参与Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用及CP-25的影响。
方法：
1.为了观察TNF-α和PGE2信号通路中关键分子在LSCC患者肿瘤组织中的表达及临床意义，课题组采用ELISA法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中PGE2,TNF-α水平，采用免疫组化法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中EP4,GRK2,TNFR1,TNFR2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达，Co-IP法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中EP4或TRAF2与GRK2的共表达情况，Western blot检测LSCC不同分期和不同类型中肿瘤和癌旁组织中GRK2,EP4,TRAF2和MMP-9的蛋白的表达水平，并将TRAF2,GRK2和MMP-9蛋白表达与LSCC临床分期的关系进行相关性分析。
2.为了观察在LSCC中，TNF-α和PGE2信号通路之间是否存在交叉对话，其在LSCC的增殖、迁移和侵袭中的影响及CP-25的作用，本研究选用人LSCC细胞株Hep-2，用PGE2或/和TNF-α刺激细胞，在CP-25的不加与加入的情况下，CCK-8法检测Hep-2细胞增殖活力，Transwell法检测细胞迁移和侵袭功能，Western blot法检测Hep-2细胞中MMP-9的表达，p-ERK的表达水平，Co-IP法检测Hep-2细胞上EP4和GRK2的共表达以及GRK2和TRAF2的共表达。
结果：
1.PGE2/GRK2信号和TNF-α/TRAF2信号关键分子在LSCC患者临床样本中的表达水平
在LSCC肿瘤组织中PGE2和TNF-α的表达较癌旁组织显著增加；肿瘤组织中EP4,GRK2,TNFR1,TRAF2和MMP-9蛋白的表达较癌旁组织显著增加，而TNFR2蛋白表达在LSCC肿瘤和癌旁组织中无明显差异；在早期和晚期LSCC肿瘤组织中TRAF2,GRK2和MMP-9蛋白表达较癌旁组织明显增加,并且GRK2,TRAF2和MMP-9蛋白表达水平在晚期肿瘤组织比早期的肿瘤组织明显增加；在LSCC早期，GRK2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达在声门上型和声门型LSCC中较癌旁组织明显增加，并且GRK2,TRAF2和MMP-9在声门上型LSCC中的蛋白表达较声门型LSCC显著增加；在LSCC晚期，GRK2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达在声门上型和声门型LSCC中较癌旁组织明显增加，但GRK2,TRAF2和MMP-9在声门上型LSCC中的蛋白表达较声门型LSCC无明显差异；在LSCC肿瘤组织和癌旁组织中也未能检测出GRK2和EP4的共表达；TRAF2与GRK2共表达在LSCC肿瘤组织中较癌旁组织明显上调。
2.PGE2/GRK2信号对Hep-2细胞功能的影响及CP-25的作用
不同浓度PGE2（1,2,4,8,16μM）诱导Hep-2细胞增殖，结果表明，诱导48h后，PGE2（1μM）可以显著促进Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭，而CP-25能抑制PGE2促进的Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭。Co-IP均未能检测出Hep-2细胞中GRK2与受体EP4存在共表达。
3.在PGE2的基础上给予TNF-α对Hep-2细胞功能的影响及CP-25的作用
PGE2（1μM）或/和TNF-α（20ng/ml）作用于Hep-2细胞，检测Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭功能以及肿瘤转移相关蛋白MMP-9的表达，结果表明，PGE2联合TNF-α较PGE2单独刺激可显著促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭功能以及MMP-9的蛋白表达；PGE2联合TNF-α作用于Hep-2细胞，再分别加入不同浓度的CP-25（10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L）作用48h，检测Hep-2细胞功能的变化以及MMP-9的表达，结果表明，在PGE2联合TNF-α较未刺激组均可以显著增强Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及上调MMP-9的表达，而CP-25（10-6mol/L,10-5mol/L）可以显著抑制PGE2联合TNF-α诱导的Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及下调MMP-9的表达。为了探索CP-25抑制Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制，Co-IP法检测结果表明，PGE2联合TNF-α作用Hep-2细胞，可以显著上调GRK2和TRAF2的共表达，而CP-25（10-6mol/L）可以显著下调GRK2和TRAF2的共表达。Western blot结果表明，PGE2联合TNF-α作用Hep-2细胞，可以显著上调ERK的磷酸化，而CP-25（10-6mol/L）可以显著下调ERK的磷酸化。
结论：
1.LSCC患者临床样本的肿瘤组织中PGE2,TNF-α水平上调，TNFR1,TRAF2,MMP-9,EP4和GRK2蛋白表达上调，而TNFR2蛋白水平未见明显升高。GRK2，TRAF2和MMP-9的表达与LSCC的分期和发生部位具有一定的相关性，期别越晚，表达越高，同期别比较，声门上型较声门型表达高。
2.PGE2/GRK2信号活化可以促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭，但其促进作用相对较弱。
3.在PGE2的基础上给予TNF-α作用可以活化PGE2/GRK2信号，较PGE2单独刺激可显著促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭，以及上调MMP-9的表达，上调TRAF2与GRK2的共表达，提示：TNF-α/TRAF2信号可以增强PGE2/GRK2信号活化，从而影响作为Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。
4.CP-25可以抑制PGE2联合TNF-α诱导的Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭以及下调MMP-9的表达，下调TRAF2与GRK2的共表达，下调ERK的磷酸化水平，提示：CP-25可能是通过下调TNF-α/TRAF2信号对PGE2/GRK2信号的活化，下调GRK2对ERK的活化，从而抑制Hep-2细胞恶性生物学功能。
1.在LSCC患者临床样本的肿瘤和癌旁组织中，观察PGE2,TNF-α,TNFR1,TRAF2,MMP-9,EP4和GRK2蛋白表达，揭示上述信号通路关键蛋白与LSCC临床分期及发生部位的关系；
2.在人LSCC细胞株Hep-2中，观察PGE2或/和TNF-α对Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用，EP4或TRAF2与GRK2的共表达，p-ERK的表达的影响及CP-25的作用，阐明TNF-α/TRAF2活化PGE2/GRK2参与Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用及CP-25的影响。
方法：
1.为了观察TNF-α和PGE2信号通路中关键分子在LSCC患者肿瘤组织中的表达及临床意义，课题组采用ELISA法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中PGE2,TNF-α水平，采用免疫组化法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中EP4,GRK2,TNFR1,TNFR2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达，Co-IP法检测LSCC患者的肿瘤和癌旁组织中EP4或TRAF2与GRK2的共表达情况，Western blot检测LSCC不同分期和不同类型中肿瘤和癌旁组织中GRK2,EP4,TRAF2和MMP-9的蛋白的表达水平，并将TRAF2,GRK2和MMP-9蛋白表达与LSCC临床分期的关系进行相关性分析。
2.为了观察在LSCC中，TNF-α和PGE2信号通路之间是否存在交叉对话，其在LSCC的增殖、迁移和侵袭中的影响及CP-25的作用，本研究选用人LSCC细胞株Hep-2，用PGE2或/和TNF-α刺激细胞，在CP-25的不加与加入的情况下，CCK-8法检测Hep-2细胞增殖活力，Transwell法检测细胞迁移和侵袭功能，Western blot法检测Hep-2细胞中MMP-9的表达，p-ERK的表达水平，Co-IP法检测Hep-2细胞上EP4和GRK2的共表达以及GRK2和TRAF2的共表达。
结果：
1.PGE2/GRK2信号和TNF-α/TRAF2信号关键分子在LSCC患者临床样本中的表达水平
在LSCC肿瘤组织中PGE2和TNF-α的表达较癌旁组织显著增加；肿瘤组织中EP4,GRK2,TNFR1,TRAF2和MMP-9蛋白的表达较癌旁组织显著增加，而TNFR2蛋白表达在LSCC肿瘤和癌旁组织中无明显差异；在早期和晚期LSCC肿瘤组织中TRAF2,GRK2和MMP-9蛋白表达较癌旁组织明显增加,并且GRK2,TRAF2和MMP-9蛋白表达水平在晚期肿瘤组织比早期的肿瘤组织明显增加；在LSCC早期，GRK2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达在声门上型和声门型LSCC中较癌旁组织明显增加，并且GRK2,TRAF2和MMP-9在声门上型LSCC中的蛋白表达较声门型LSCC显著增加；在LSCC晚期，GRK2,TRAF2和MMP-9的蛋白表达在声门上型和声门型LSCC中较癌旁组织明显增加，但GRK2,TRAF2和MMP-9在声门上型LSCC中的蛋白表达较声门型LSCC无明显差异；在LSCC肿瘤组织和癌旁组织中也未能检测出GRK2和EP4的共表达；TRAF2与GRK2共表达在LSCC肿瘤组织中较癌旁组织明显上调。
2.PGE2/GRK2信号对Hep-2细胞功能的影响及CP-25的作用
不同浓度PGE2（1,2,4,8,16μM）诱导Hep-2细胞增殖，结果表明，诱导48h后，PGE2（1μM）可以显著促进Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭，而CP-25能抑制PGE2促进的Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭。Co-IP均未能检测出Hep-2细胞中GRK2与受体EP4存在共表达。
3.在PGE2的基础上给予TNF-α对Hep-2细胞功能的影响及CP-25的作用
PGE2（1μM）或/和TNF-α（20ng/ml）作用于Hep-2细胞，检测Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭功能以及肿瘤转移相关蛋白MMP-9的表达，结果表明，PGE2联合TNF-α较PGE2单独刺激可显著促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭功能以及MMP-9的蛋白表达；PGE2联合TNF-α作用于Hep-2细胞，再分别加入不同浓度的CP-25（10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L）作用48h，检测Hep-2细胞功能的变化以及MMP-9的表达，结果表明，在PGE2联合TNF-α较未刺激组均可以显著增强Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及上调MMP-9的表达，而CP-25（10-6mol/L,10-5mol/L）可以显著抑制PGE2联合TNF-α诱导的Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭以及下调MMP-9的表达。为了探索CP-25抑制Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制，Co-IP法检测结果表明，PGE2联合TNF-α作用Hep-2细胞，可以显著上调GRK2和TRAF2的共表达，而CP-25（10-6mol/L）可以显著下调GRK2和TRAF2的共表达。Western blot结果表明，PGE2联合TNF-α作用Hep-2细胞，可以显著上调ERK的磷酸化，而CP-25（10-6mol/L）可以显著下调ERK的磷酸化。
结论：
1.LSCC患者临床样本的肿瘤组织中PGE2,TNF-α水平上调，TNFR1,TRAF2,MMP-9,EP4和GRK2蛋白表达上调，而TNFR2蛋白水平未见明显升高。GRK2，TRAF2和MMP-9的表达与LSCC的分期和发生部位具有一定的相关性，期别越晚，表达越高，同期别比较，声门上型较声门型表达高。
2.PGE2/GRK2信号活化可以促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭，但其促进作用相对较弱。
3.在PGE2的基础上给予TNF-α作用可以活化PGE2/GRK2信号，较PGE2单独刺激可显著促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭，以及上调MMP-9的表达，上调TRAF2与GRK2的共表达，提示：TNF-α/TRAF2信号可以增强PGE2/GRK2信号活化，从而影响作为Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。
4.CP-25可以抑制PGE2联合TNF-α诱导的Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭以及下调MMP-9的表达，下调TRAF2与GRK2的共表达，下调ERK的磷酸化水平，提示：CP-25可能是通过下调TNF-α/TRAF2信号对PGE2/GRK2信号的活化，下调GRK2对ERK的活化，从而抑制Hep-2细胞恶性生物学功能。