癫痫是一种多种病因导致的临床综合征,以脑部神经元高度同步化异常放电引起的发作性、短暂性、重复性和刻板性的中枢神经系统功能障碍为特点,是最常见的神经系统疾病之一。全球约有5000万,我国约有900万癫痫患者,患病率约为5‰,其中难治性癫痫约占25%,抗癫痫药物和手术治疗效果不佳,且发病机制目前尚未完全清楚。众多研究证实,胆碱能受体激动剂匹鲁卡品和兴奋性毒性谷氨酸受体激动剂海人酸(kainic acid, KA)诱导的癫痫动物模型,在行为学、神经电生理学及海马神经元损伤的病理学方面与人类难治性癫痫尤其是颞叶癫痫类似,是常用的颞叶癫痫体内动物模型。1995年Sombati等利用无镁细胞外液诱导体外培养的海马神经元产生自发性反复性癫痫样放电(spontaneous recurrent epileptiform discharges, SREDs),建立了癫痫体外细胞模型,具有快捷有效、可靠稳定、便于观察药物效应和电生理变化的特点,并且排除了化学致痫药物本身的毒性干扰,在探索新型抗癫痫神经保护药物方面发挥了重要作用。聚腺苷二磷酸核糖多聚酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]主要存在于真核细胞核中,是一类非组蛋白染色体蛋白质,其主要生物学功能包括：(1)修复DNA损伤并维持基因稳定性；(2)调节相关蛋白的转录水平,影响其表达；(3)影响复制和分化,参与维持端粒长度；(4)清除机体内部损伤细胞,调控细胞死亡。其中PARP-1是PARP家族成员中含量最高(90%以上)、研究最清楚的蛋白。在生理状态下,PARP-1被DNA断裂损伤激活,形成同型二聚体并将烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)分解为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖大分子聚合物,聚腺苷二磷酸核糖[poly(ADP-ribose), PAR]可与组蛋白、转录因子及PARP-1结合,调节其活性和功能,利JDNA修复的进行。而DNA受损严重时,PARP-1被过度激活,大量消耗细胞内NAD+和ATP,激活细胞死亡相关蛋白,引起炎症反应,可见PARP-1的生物学效应是一把双刃剑。研究发现,PARP-1的药物抑制或基因敲除在神经系统退行性病变、外伤、炎症、缺血再灌注和癫痫等疾病中发挥了明显的神经保护作用。PARP-1过度激活介导细胞损伤的机制很复杂,主要包括：Caspase依赖性细胞凋亡,非Caspase依赖性细胞死亡,炎性介质过度表达,能量代谢障碍和Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶活性增高等。近期观点认为,PARP介导细胞死亡的形态学与分子生物学特征同经典的凋亡与坏死存在明显的区别,为非Caspase依赖性细胞死亡的一种,并被命名为Parthanatos。其生化特征包括：PARP迅带激活,早期PAR的积累,线粒体膜电位去极化并通透性改变,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)向细胞核转位,细胞内NAD+(?)(?)ATP大量消耗,晚期Caspase激活,细胞萎缩等。近期研究发现沉默信息调节因子2同源蛋白1(silencing information regulator2homolog1,SIRT1)能够通过调节细胞能量代谢、生长分化发挥保护作用,但其生物学效应受NAD+水平制约。因此对PARP-1, NAD+, AIF, SIRT1等潜在靶点的调控可为PARP(?)(?)关性疾病的治疗开辟新的途径。然而,Parthanatos的具体机制尚未完全明确,在癫痫病理生理过程中的作用研究较少。为此,本课题建立无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型,排除体内众多因素的影响,模拟边缘系统受损性癫痫,探讨癫痫体外模型中海马神经元的电生理特性,并应用多种药物干预手段,检测PARP-1介导的细胞死亡信号通路和相关蛋白变化,以此深入研究癫痫的分子生物学机制并为癫痫的治疗提供新的靶点。本研究为三个部分：第一部分无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型的建立及形态学、电生理学观察目的建立无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型,观察自发性癫痫放电对体外培养大鼠海马神经元细胞形态学及电生理学特征的影响。方法采用新生24h内的Sprague-Dawley大鼠断头取脑,显微镜下分离海马神经元进行的原代培养。培养过程中观察神经元的形态学特征,并用培养至14d的细胞用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)抗体,采用免疫细胞化学技术鉴定神经元纯度。培养至14d的海马神经元经过无镁细胞外液处理3h后恢复至正常培养基,在不同时间点采用全细胞膜片钳技术记录神经元放电情况,验证无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型建立成功。结果1.细胞形态学特征：刚接种至六孔板培养基内的海马神经元为小圆形,散在分布。大部分神经元在培养12-24h后贴壁,突起明显增多,长短不一。培养至7d,已具有典型的轴突与树突,细胞结构立体,折光感强,细胞核呈空泡状,神经元间尚未形成突触联系,为单个生长的细胞。10d左右神经元间形成突触联系,呈网状结构。培养10-14d时,细胞体积最大,突起最为清晰,网络最为密集。至25-28d,培养液中有悬浮的细胞碎片。2.神经元纯度检验：培养至14d的神经元细胞爬片采用免疫细胞化学技术染色后,神经元的胞浆和突起被染成棕色,镜下计数后神经元纯度可达94.7%。3.电生理学特征：在正常生理外液中,大部分神经元可记录到正常突触后电活动,包括兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential, EPSP)、抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential, IPSP)和偶发动作电位(action potential, AP)。其静息电位范围为-60--40mV,动作电位幅度为15～30mV。神经元在无镁刺激过程中,放电形式发生改变,表现为持续强直性高频爆发和“楔形”去极化。经无镁处理3h并恢复正常培养基后,表现为阵发性持续棘波样爆发,另外存在有“楔形”去极化及阵发性去极化偏移(paroxysmal depolarizing shifts,PDS)。无镁刺激恢复正常后持续至96h仍可检测到周期性自发放电表现。结论1.本研究所用方法培养的大鼠海马神经元在数量、纯度、存活时间方而较好,表面光滑,轮廓清楚,有较强的立体感,具有适于膜片钳研究的细胞结构基础。2.本模型中海马神经元虽为体外培养,但神经元之间能形成广泛的突触网状联系,具有信息传递的形态学基础。3.无镁刺激能诱发神经元产生持久的自发性反复性放电,与癫痫发作时电生理活动类似,具有体外癫痫细胞模型研究的电生理基础。4.无镁诱导海马神经元癫痫放电模型稳定可靠、可控性强,是良好的癫痫细胞模型,为研究癫痫病理生理机制及新型抗癫痫药物的研发提供了良好平台。第二部分PARP-1调控无镁致痫大鼠海马神经元中AIF表达、分布及PI3K/Akt信号通路的机制研究目的评估无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型中的细胞生存状态：探讨神经元内AIF的表达、分布及PI3K/Akt信号通路随时间的变化规律；探讨PARP-1及其抑制剂DPQ(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-1(2H)一isoquinolinone)对上述指标的调节作用及相关机制。方法1.将体外培养至14d的大鼠海马神经元随机分为对照组、尤镁组、在镁+Z-VAD-FMK(Caspase抑制剂)组、无镁饮+DPQ组,均选用致痫后1h、24h两个时间点,采用FUNEI及LDH检测法,评估无镁诱导后神经元死亡情况,并探讨DPQ对其影响。2.将大鼠海马神经元随机分为对照组、无镁组、无镁+DMSO祖、无镁(?)DPQ组、无镁+dpq+WTN(wortmannin,PI3K抑制剂组,提取总蛋白、细胞核及线粒体蛋白,采用Western blot法检测PAR、PARP-1AIF、(p-)Akt、(p-)GSK3β的表达3.采用细胞免疫荧光共聚集技术,检测AIF在神经元内的分布。结果1.无镁诱导后24h,TUNEL细胞核阳性率可达71.2%：而在镁+FMK组及无镁+DPQ组的该比例分别降至45.25%和26.88%,LDH漏出率分别为在镁24h组的57.35%和36.94%。2.PAR的蛋白量在无镁诱导3h后显著升高,24h达最高水平。线粒体中AIF表达量随时间降低,诱导后24h达最低水平(p<0.05)；与之对应,细胞核中AIF表达逐渐增高。无镁+DPQ组中PAR表达量下降,线粒体内AIF的含量明显高于无镁+DMSO组(p<0.05)；细胞核内AIF含量则显著降低(p<0.05)。细胞免疫荧光检测结果与上述趋势相一致。3.无镁诱导后,Akt、GSK3β磷酸化水平在1h显著降低(p<0.05),在12h基本恢复至对照组水平。无镁+DPQ组Akt及GSK3β磷酸化水平显著高于无镁+DMSO组(p<0.05)。而无镁+DPQ+WTN组,Akt、GSK3P磷酸化水平及线粒体内AIF表达显著低于无镁+DPQ组(p<0.05),细胞核内AIF表达则与之相反。结论无镁诱导大鼠海马神经元癫痫模型中,PARP-1被过度激活,导致AIF由线粒体向细胞核内转位,神经元大量死亡。而PARP-1抑制剂DPQ通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路,抑制AIF向细胞核的转位,减少神经元死亡,发挥了细胞保护作用。第三部分PARP-1调节无镁致痫大鼠海马神经元中NAD+及SIRT1水平的机制研究目的探讨无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型中,PARP-1介导的细胞死亡与神经元内NAD+含量、SIRT1的表达及去乙酰化活性的关系；探讨细胞内NAD+含量对AIF由线粒体向细胞核转位的作用。方法将体外培养至14d的大鼠海马神经元随机分为对照组、无镁组、无镁+DPQ组、无镁+NAD (5,10mM)组、无镁+白藜芦醇(resveratrol, SIRT1激动剂)组及无镁+sirtinol (SIRT1抑制剂)组。检测无镁诱导后NAD+的含量、SIRT1的mRNA和蛋白水平随时间的变化规律：探讨应用DPQ或NAD干预后,TUNEL阳性细胞率与NAD+水平的变化关系、PARP-1的表达与活性状态、AIF的胞内分布以及SIRT1(?)的表达和活性对神经元存活状况的影响。结果1.无镁组大鼠海马神经元内NAD+含量随时间逐渐下降。与无镁组相比,无镁+DPQ组的NAD+含量显著增高(p<0.05),TUNEL阳性细胞率显著降低(p<0.05)。2.细胞免疫荧光和Western blot(?)支术均证实,无镁24h+NAD组神经元细胞核AIF的蛋白表达量显著低于无镁24h组(p<0.05),而线粒体AIF表达量高于无镁组(p<0.05)。3.SIRT1的mRNA水平随无镁诱导后时间延长而增高,但蛋白水平与对照{组无显著差异；应用DPQ或NAD干预后SIRT1的mRNA水平较在镁明显著降低(p<0.05),但蛋白水平与无镁组相比无显著差异。4.在镁+DPQ组SIRT1去乙酰化活性是无镁组的3倍,TUNEL阳性率为27.62%。无镁+resveratrol组将SIRT1(?)活性提高至无镁组的3.72倍,TUNEL阳性率为35.73%。无镁+sirtinol组SIRT1活性显著降低,TUNEL(?)(?)性率与无镁组无显著差异(p>0.05)。5.无镁组PAR蛋白表达量显著高于对照组(p<0.05),无镁+DPQ组PAR表达量显著低于在无镁组(p<0.05),而无镁天+NAD组PAR表达量与无镁组相比在明显差异,各组PARP-1蛋白水平无显著差异,结论无镁诱导大鼠海马神经元癫痫模型中,PARP-1被过度激活,胞内NAD急剧消耗,SIRT1去乙酰化活性下降,AIF由线粒体向细胞枋核内转位,神经元大量死亡。补充外源性NAD+能抑制AIF转位,减少神经元死亡；而SIRT1作为PARP-1和NAD+的下游分子,其活性(而不是蛋白表达量)与神经元死亡率呈负相关。因此神经元内NAD+含量与SIRT1去乙酰化活性的下降为PARP-1介导的无镁致痫神经元的死亡机制提供了另一条通中。