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本研究以水曲柳为材料,克隆15个水曲柳4CL基因,分别命名为Fm4CL1-Fm4CL15,已上传至NCBI并获得登录号。对15个水曲柳Fm4CL基因进行了生物信息学及表达模式分析。构建了植物表达载体pBI121-Fm4CL2和pBI121-Fm4CL4,并成功转化烟草,获得转基因植株。测定转基因烟草中木质素、纤维素和半纤维素的含量及木质素合成途径相关酶PAL和POD的含量。并通过显微切片观察对比分析了转基因与非转基因烟草木质部细胞大小及形态差异。初步揭示了水曲柳Fm4CL的表达模式及功能。主要研究结果如下:1、水曲柳Fm4CL基因生物信息学分析本研究对15个Fm4CL全长基因进行了生物信息学分析。利用在线分析软件分析了理化性质,并对其蛋白结构进行了分析。结果表明,Fm4CL2、Fm4CL3、Fm4CL6、Fm4CL10、Fm4CL14 为不稳定蛋白,其余为稳定蛋白。Fm4CL1、Fm4CL3、Fm4CL4、Fm4CL7、Fm4CL8、Fm4CL10为亲水性蛋白,其余为疏水性蛋白。全部的Fm4CL蛋白有跨膜结构域,说明Fm4CL蛋白具有跨膜能力。全部的Fm4CL蛋白都是由α螺旋、延伸链、无规则卷曲所组成的,并且分布于整个蛋白。同时构建了系统发育进化树。2、水曲柳Fm4CL基因表达模式分析对水曲柳叶片、木质部、外皮、花、芽、种子取材,分析Fm4CL基因在不同组织中的表达水平。对水曲柳叶片、木质部、外皮分别于5月、6月、7月、8月、9月取材,分析Fm4CL基因在不同时间的表达水平。结果表明水曲柳Fm4CL基因具有时空表达特异性。对水曲柳分别进行1天、3天、7天的应拉处理,同时取应拉侧和对应侧的木材。结果表明,Fm4CL基因在应拉木处理材料中的表达模式各不相同,但均对应拉处理有响应,初步说明Fm4CL可能参与细胞壁与木质素的合成。3、利用In-Fusion技术进行了表达载体的构建并探讨影响烟草转化效率的因素利用In-Fusion克隆技术获得了两个植物表达载体pBI121-Fm4CL2和pBI121-Fm4CL4。本研究最终确定了烟草分化最适培养基为MS+0.05mg/LNAA+0.5mg/L6-BA,侵染菌液浓度为OD600=0.3,最适侵染时间为4min,最适共培养时间为3天。共培养后,初始脱菌浓度和筛选浓度分别为:头孢霉素500mg/L,卡那霉素25mg/L。脱菌培养一周后,将卡那霉素浓度提升至50mg/L,头孢霉素浓度不变。确定不再长出农杆菌后将头孢霉素降至300mg/L,随后逐渐降低头孢霉素浓度,直至不再加入。待芽长至3cm时切下转入生根筛选培养基中,获得转基因烟草。4、Fm4CL2和Fm4CL4基因功能的初步分析对转基因烟草进行了 GUS检测和分子鉴定,证明成功获得了转基因烟草植株。与非转基因对照相比,转基因烟草木质素含量升高,纤维素和半纤维素含量降低,但木质素和纤维素总的含量不变,说明木质素与纤维素的合成可相互补偿。同时,测量了木质素合成相关酶的活性,位于苯丙酸途径入口处的PAL含量降低,最后合成木质素的关键酶POD含量升高。推测4CL的含量增加反馈性抑制PAL的合成,但整体的4CL含量增加导致了木质素单体含量的增加,所以POD的含量高于非转基因烟草。显微观察烟草石蜡切片,可清楚的看到转基因烟草木质部细胞相对于非转基因烟草体积更小更紧密,Fm4CL2和Fm4CL4单细胞面积分别比对照低26.5%和23.5%。