目的:MCF-7是人源乳腺癌细胞, ER、PR、VEGF均阳性表达,本实验分为两部分,通过体外实验观察乳岩宁方对MCF-7细胞凋亡的影响,通过体内实验观察乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的抑瘤作用、抑制MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤血管生成及对磷酸化Akt蛋白表达水平的影响,来探讨乳岩宁方的作用机制,可能与PI3K/Akt信号转导通路相关。材料与方法:实验细胞株:MCF-7购于湖南湘雅医学院中心实验室细胞库(美国标准生物品收藏中心ATCC制备)。实验动物:SPF级小鼠(4-6周龄)50只雌雄各半,体重20±2 g ;雌性BALB/c-nu/nu裸鼠(4-6周龄)30只,体重20±2 g购于大连医科大学实验动物中心实验动物质量合证:SCXKGGD2004-0017。实验方法:一、含乳岩宁方SPF小鼠血清制备:50只SPF级小鼠适应性喂养3天,随机分为对照组、用药组,用药组按人与小鼠体表面积比值折算成相当于人临床剂量10倍量给药,对照组灌服等体积生理盐水,于每天上、下午相同时间(每次间隔12小时)灌胃,连续灌胃7天,后禁食不禁水,于末次给药2次,中间间隔lh,于最后一次给药后l小时,无菌操作下取血。血样常温放置4小时后4℃过夜,离心2000rpm×15min,0.22um微孔滤膜过滤分装于EP管中,-20℃保存,使用前56℃水浴灭活30min。二、MTT比色法测定乳岩宁含药血清对MCF-7细胞增殖的影响实验步骤:1将对数生长期的细胞以0.25%的消化胰酶/EDTA 800ul消化,用10%FBS的DMEM制成单细胞悬液;2调整细胞浓度为2×105/ml,接种于3块96孔板中,每孔200ul,于37℃,5%CO2饱和湿度条件培养24 h; 3换用0.5%FBS的DMEM培养基,继续于37℃,5%CO2饱和湿度条件培养24 h,同步细胞于G0/G1期;4根据DMEM培养基中血清来源不同将细胞随机分为6组,即5%正常血清组、10%正常血清组、20%正常血清组及相同体积分数的5%中药血清组、10%中药血清组、20%中药血清组,每组设10个复孔;5每孔分别添加各组不同体积分数血清及DMEM培养基,每孔终体积为200ul,继续分别培养24 h、48 h、72 h;6在不同的终点时间均换成无血清DMEM100ul,并加入MTT (5mg/ml) 20uL,孵育4 h后,吸弃培养液,然后加入二甲基亚砜( DMSO) 150uL/孔,放于水平摇床轻微震荡10 min;7用酶标仪在490nm波长处测定吸光度(OD值),结果取均值;计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。三、AO/EB荧光染色法观察乳岩宁对MCF-7细胞凋亡的影响取对数生长期MCF-7细胞,PBS液洗涤1次,0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成104个/ml的细胞悬液。以每孔2ml体积接种于6孔板,孔内放玻片。细胞培养生长抑制2天后,分为乳岩宁含药血清浓度为5%、10%、20%、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h。1天后,吸去培养液,取出6孔板的玻片,PBS洗3次后,10%甲醛固定30分钟, AO/EB染色,碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为405 nm。每组分别计数3次,每次计数细胞300个,计算凋亡率,用SPSS10.0软件X2检验进行统计分析,确定影响凋亡的含药血清浓度。含药血清浓度为20%组,凋亡率最高,因此以下实验选择用20%浓度含药血清进行实验。四、流式细胞仪检测MCF-7细胞周期。五、乳岩宁对MCF-7细胞BAX/BCL2/ Caspase3蛋白表达的影响取对数生长期的MCF-7细胞,用0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,配成104个/ml的细胞悬液,以每瓶5ml体积接种于培养瓶中,每2天换液一次。在含有10%胎牛血清低糖DMEM培养基中培养,待其生长至70%融合时,换用0.5%FBS的DMEM培养基继续培养24 h,同步细胞于G0/G1期。将细胞分为对照组(含20%空白血清)和中药血清组(含20%中药血清),培养24 h,1天后,倒去培养液。将细胞培养液吸弃,预冷PBS洗细胞2次,倒出PBS,加入预冷的细胞裂解液,置冰上裂解细胞;细胞样品完全破碎后,用细胞刮刮下细胞,移至准备好的1.5ml的EP管中。冷冻高速离心机中离心,4℃1500转/min离心20分钟,取上清,即是蛋白。用Western blot的方法进行检测。六、乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡相关信号转导机制Western blot检测P-AKT蛋白表达取对数生长期平滑肌细胞,用PBS液洗涤1次,用0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,制成单细胞悬液,以每瓶5ml体积接种于培养瓶中,于37℃,5%CO2条件下培养;待其生长至70%融合时,换用0.5%FBS的DMEM培养基继续培养24 h,同步细胞于G0/G1期;将细胞分为正常血清组(含20%空白血清)和中药血清组(含20%中药血清),培养24 h;在终点时间,更换含有PDGF-BB(5ng/ml)的培养基继续孵育30 min;分别于5min、10min、20min、30min将细胞培养基吸弃,细胞刮收集细胞,后续Western blot检测。七、以及MCF-7荷瘤裸鼠病理切片制备、透射电镜观察细胞凋亡微观状态、免疫组化检测细胞凋亡原位杂交(TUNEL)法、MVD表达、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达,以及Western blot法对PI3K-Akt蛋白检测等。结果:1. MTT检测提示乳岩宁20%含药血清干预24小时对MCF-7有明显抑制作用。流式细胞仪凋亡检测试剂盒(AnnexinⅤ-FITC)检测提示乳岩宁含药血清可诱导MCF-7细胞凋亡。2.流式细胞仪细胞周期检测提示乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞停滞于G0/G1-S期,且呈量效关系。3.蛋白检测乳岩宁含药血清可下调BCL-2蛋白表达,提高Bax及Caspase3蛋白表达,降低Bcl-2/Bax比值,下调P-Akt表达,说明乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡机制之一是通过影响PI3K/Akt通路中磷酸化Akt蛋白表达水平,进而干预细胞周期相关调控蛋白的表达实现。4. MCF-7荷瘤裸鼠在体实验病理、电镜形态学观察细胞凋亡微观状态,免疫组化检测细胞凋亡原位杂交(TUNEL)法、蛋白检测P-Akt弱表达,印证乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠亦具有诱导细胞凋亡作用。5.乳岩宁方分组干预后免疫组化检测MCF-7荷瘤裸鼠MVD下降、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达下调,说明乳岩宁方具有抑制乳腺癌血管生成作用,对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有多靶点治疗作用。结论:1.乳岩宁方对MCF-7细胞及MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有诱导细胞凋亡作用。诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制与PI3K/Akt信号转导通路相关。2.乳岩宁方具有抗MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌血管生成作用。