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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)为无嚢膜的单股负链DNA病毒,属圆环病毒科(Circoviridae)成员。其基因组为单股环状DNA,病毒粒子无囊膜,呈二十面体对称,是目前已知的最小病毒之一。PCV有1型(PCV1)和2型(PCV2)两种基因型,PCV1首先由Tiseher于PK-15细胞中发现,基因组全长1759bp,无致病变性;PCV2基因组长1767bp或1768bp,被认为是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。PMWS是一种以进行性消瘦和多系统病理损伤为主要特征的免疫抑制性疾病,主要发生在6-16周龄的断奶仔猪。该病在我国自2000年首次报道以来,已广泛流行于全国各省,威胁着我国的养殖业,并造成了巨大的经济损失。因此加强PCV2的病原学检测和临床诊断有重要意义。本研究主要包括以下几方面内容:本研究通过PCR扩增,从河南南阳一猪场送检的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病猪腹股沟淋巴结中检测到猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)核酸,将病料研磨、过滤除菌后接种无PCV1和PCV2污染的PK-15细胞,盲传8代后用PCR方法仍然能够在接种细胞中检测到PCV2核酸,PRV、PRRSV、PPV、PCV1的PCR检测均为阴性。从接毒细胞中收获病毒处理后电镜观察,可见到均一的病毒样粒子,通过间接免疫荧光试验也观察到感染PCV2的PK-15细胞中的特异性荧光,将该分离株命名为HN-PCV2株。设计一对引物,扩增该分离株的全基因组,与GenBank上已收录的PCV1和PCV2序列进行同源性比较和进化树分析。序列分析表明,该分离株属于欧洲分离株系,病毒全基因组长1767 bp,包含11个开放阅读框,与PCV1的核苷酸同源性是70%左右,与其他PCV2株的同源性介于94.0%~99.2%,ORF1核苷酸同源性介于96.1%~99.7%,氨基酸同源性介于95.2~98.1%,ORF2核苷酸同源性介于92.0%~99.3%,氨基酸同源性介于93.2%~99.1%。根据已报道的猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,设计并合成1对引物,建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型的SYBR-GreenⅠ实时定量PCR。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为9拷贝/μL,特异性和重复性较好。此方法以闭管的模式操作,减少了后续步骤污染的可能性,整个PCR检测过程不超过3个小时。无菌采集6头PMWS患猪的心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏和腹股沟淋巴结,利用普通PCR对6头自然感染PCV2猪的体内不同脏器PCV2进行定性检测,再利用已建立好的实时定量PCR进行定量检测。结果表明,PCV2感染呈多脏器分布,自然感染猪的腹股沟淋巴结、肾脏和脾脏中病毒含量能达到7.39×1010拷贝/g、1.80×1012拷贝/g、8.43×109拷贝/g,其次是肺脏,最后是肝脏和心脏,同设对照组猪只组织脏器检测结果均为阴性。同时也表明PCV2主要在免疫器官中增殖,导致淋巴细胞耗损。本研究为临床快速诊断提供重要价值,且为PCV2致病机理及组织嗜性的研究奠定了基础。