【摘 要】
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目的:外泌体来源的mi RNA能够调控重要的细胞活动,参与COPD的发生、发展。本研究拟探讨血清外泌体中mi RNA在COPD大鼠中的表达情况并进行生物信息学分析及实验验证阐明血清外泌体中mi RNA在COPD中的作用。方法:1.COPD动物模型建立:12只6-8周龄、体重160-180g的SD雄性大鼠随机分为实验组和对照组。通过被动熏烟+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶构建COPD大鼠模型。被动熏烟15
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目的:外泌体来源的mi RNA能够调控重要的细胞活动,参与COPD的发生、发展。本研究拟探讨血清外泌体中mi RNA在COPD大鼠中的表达情况并进行生物信息学分析及实验验证阐明血清外泌体中mi RNA在COPD中的作用。方法:1.COPD动物模型建立:12只6-8周龄、体重160-180g的SD雄性大鼠随机分为实验组和对照组。通过被动熏烟+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶构建COPD大鼠模型。被动熏烟15周后,完成肺功能检査,颈椎脱臼法处死大鼠。分离肺组织及收集血清。血清用于提取外泌体,肺组织用于包埋制成蜡块进行HE染色。2.血清外泌体分离及mi RNA提取:运用超速离心法分离外泌体,电镜观察分析外泌体粒径,Western-blot检测外泌体标志蛋白。提取出的外泌体使用RNA裂解液提取外泌中的mi RNA,检测mi RNA的浓度及纯度。3.外泌体中mi RNA生物信息学分析:采用R软件的数据集Illumina对初始数据进行归一化处理后,使用|log2（FC）|≥0.5849;P Value≤0.05作为筛选标准来筛选COPD相关的差异表达基因,对差异表达的mi RNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析。4.细胞实验验证:制备香烟烟雾提取物后,分别用0.5%,1%,2%的香烟烟雾提取物处理人支气管上皮细胞,transwell法检测细胞侵袭能力。筛选出合适的香烟烟雾提取物浓度,建立体外干预人支气管上皮细胞的模型,q PCR检测mi RNA表达水平及q PCR、Western Blot检测细胞中α-SMA、α-catenin、E-cadherin、N-cadherin表达情况。结果:1.COPD造模（1）一般表现:对照组大鼠呼吸平稳,皮肤毛发光泽正常,体重正常增加,大小便正常。实验组大鼠呼吸急促,部分张口呼吸,皮肤毛发缺乏光泽,部分有脱毛现象,烟熏过程中出汗多,进食进水量较对照组减少,体重减轻,大便干结。（2）肺功能:与对照组相比,实验组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）肺组织HE染色:对照组大鼠小气道管壁正常,无明显断裂及增厚,无炎症细胞浸润,肺泡结构正常。实验组大鼠小气道支气管壁增厚,气道周围炎症细胞浸润,肺泡结构紊乱,呈现囊状扩张,部分肺泡融合成肺大疱。2.血清外泌体及mi RNA:外泌体电镜质量评估:形态完整、球形、大小均一;外泌体粒径质量评估:颗粒浓度10^7～10^11 Particles/m L,粒径大小30–140nm;外泌体蛋白质量评估:CD9、CD63、TSG101有条带;提取RNA总量:45.0-79.1ng。3.外泌体mi RNA生物信息学分析:用生物信息学方法分析血清外泌体中差异表达的mi RNA,筛选出15个差异表达的mi RNAs,上调的mi RNAs有8个,下调的mi RNAs有7个。4.细胞实验:用不同香烟烟雾提取物浓度处理人支气管上皮细胞后,0.5%浓度干预细胞侵袭性增强,选择该浓度进行下一步实验。0.5%香烟烟雾提取物处理细胞后,q PCR验证筛选的mi RNA,其中mi R-182-5p、mi R-185-5p表达减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。同样的香烟烟雾提取物浓度干预细胞后,α-catenin、E-cadherin表达减少,α-SMA、N-cadherin表达增强,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.筛选COPD大鼠模型中差异表达的mi RNA,共得到15个有差异表达的mi RNA,其中表达上调的mi RNA有8个,表达下调的mi RNA有7个。2.使用香烟烟雾干预人支气管上皮细胞,筛选出的外泌体源性的mi R-182-5p、mi R-185-5p表达减少,提示其可能参与了COPD的发生、发展。3.差异表达的mi RNA可能通过支气管上皮细胞的上皮-间质转化参与COPD的发生、发展。
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