背景:表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK。OMIM:144200)属于一种较为常见的常染色体显性皮肤遗传病，是高度遗传异质性的掌跖角化症最为常见的亚型。EPPK的主要致病基因为表达角蛋白9(keratin9，K9)分子的KRT9基因，少数病例由KRT1基因突变引起。EPPK患者出生后数周到数月内即逐渐开始出现典型的临床症状，并持续终生。主要临床表现为整个手掌和脚掌表皮的弥漫性角质增厚，色黄，在增厚的表皮周边有明显的红斑缘，许多患者伴多汗、臭汗症。某些患者还伴发指节垫、断指或先天性指屈曲等症状。目前，EPPK尚无有效的治疗手段。国内外的绝大多数研究报道尚聚焦于EPPK的变异组学。　　目的:在完善小鼠KRT9基因突变敲入模型表型分析的基础上，探索一种可行、高效的EPPK个性化基因治疗方案，为EPPK的后续临床基因治疗、用药治疗等研究奠定基础。　　方法:　　(1)本课题组前期已报道发现几个南方汉族EPPK家系特有一种KRT9基因indel突变类型:c.500_500delAinsGGCT(p.Tyr167delinsTrpLeu)，并据此通过基因打靶技术构建了Krt9/c.434delAinsGGCT(p.Tyr144delinsTrpLeu)突变敲入小鼠模型。本研究进一步对突变小鼠的足底皮肤进行深入的表型和病理学分析（H&E染色、电镜观察等），以确定模型小鼠的EPPK样病理改变;并从分子角度分析突变小鼠的足底皮肤组织K9蛋白的变化，以及K9蛋白的突变对其他蛋白质表达的影响。　　(2)分别构建人和小鼠的萤火虫荧光素酶报告基因野生型和c.434delAinsGGCT突变型萤火虫荧光素酶慢病毒表达载体，即pfLUC-Homo-ex1KRT9/c.500delAinsGGCT/wt(pfLUC-ex1KRT9-mutant/wt)和pfLUC-Mus-ex1Krt9-c.434delAinsGGCT/wt(pfLUC-ex1Krt9-mutant/wt)，以荧光素酶报告实验为依据，按照EPPK患者和c.434delAinsGGCT突变小鼠的角蛋白9基因序列设计16条候选siRNA分子，筛选并验证功能性和特异性相对最好的靶向治疗siRNA，以达到敲降突变的Krt9等位基因表达量而对正常Krt9等位基因无影响或影响极小的目的。依据所筛选的siRNA序列，构建特异性靶向治疗shRNA慢病毒载体（即lv-sh-K9mut-8），以人永生化角质形成细胞系HaCat为对象，用lv-sh-K9mut-8对其进行转染，观察有无脱靶效应。　　(3)将慢病毒载体候选靶向shRNA(lv-sh-K9mut-8)注射治疗12周龄的Krt9+/mut突变杂合小鼠，观察EPPK样病理症状是否得到缓解等表型变化;从组织病理和分子水平上分析治疗后的角化增生症状是否得到改善;分析靶向shRNA(lv-sh-K9mut-8)是否引发了不良的免疫反应。　　结果:　　(1) Krt9/c.434delAinsGGCT(p.Tyr144delinsTrpLeu)突变敲入杂合性成年小鼠的前、后爪在11～12周时出现稳定、明显的EPPK样病理表型。H&E染色显示足垫凸起处表皮增厚、表皮扩张和角化过度症状，乳头状瘤状增生，显著的颗粒细胞增多症和棘皮症，以及具有不典型形状的表皮上部中的空泡化细胞。透射电镜超微结构分析显示，角化细胞的细胞裂解和表皮的基底层中的纤维丝的异常聚集。免疫荧光染色显示，K9突变小鼠足垫中PCNA和p63阳性细胞的数量和染色强度增加;应激反应和创伤愈合角蛋白K6和K16在Krt9+/mut和Krt9mut/mut小鼠中的表达显著高于Krt9+/+野生型小鼠;表达于基底上层的角蛋白K1和K10因K9的功能障碍而显著增高，并具有局部扩张和异常聚集的现象。免疫印迹试验（Western blot）分析显示，Krt9+/+和Krt9+/mut小鼠的K2表达量与野生型小鼠相比减少了60％。　　(2)以Krt9/c.434delAinsGGCT和KR T9/c.500delAinsGGC小插缺突变为靶向siRNA治疗的研究对象，经16条候选siRNA分子验证之后，发现si-K9mut-8的功能性和特异性相对效应最好，仅敲降突变K9分子，而对正常K9蛋白影响极小。因此，以si-K9mut-8分子的碱基序列设计合成了慢病毒表达shRNA载体(lv-sh-K9mut-8)，转染HaCat细胞系，进一步明确lv-sh-K9mut-8对突变KRT9基因的靶向抑制效率。实验结果表明，si-K9mut-8无明显的脱靶效应。　　(3)Krt9+/mut突变杂合小鼠第10天和20天各1次的候选靶向shRNA注射治疗之后，肉眼可见病鼠的角化过度症状减轻，显示了表型上的治疗改观;检测治疗后的突变小鼠的前爪足垫突起处组织的增殖蛋白标记（PCNA、p63、involucrin和filaggrin）和细胞骨架角蛋白分子(K10、K1、K6、K16、K14、K5和K2e)，发现shRNA治疗部分修复了病鼠的病理学改变，而没有引起明显的不良免疫应激反应。　　结论:靶向特异性shRNA可能是一种具有较大潜力的EPPK个性化基因治疗方案，并可为其他单基因遗传性皮肤病的基因治疗提供思路和借鉴。