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甘油(Glycerol)又称丙三醇,是主要的化工原料,被广泛应用于食品、医药、化工和护理等行业。由于其用途广泛、新附加值产品不断出现,导致甘油用量急剧增加。目前,我国的甘油主要依赖进口,为保证稳定、高效的供给,亟需寻找新的生产方法。微生物发酵法由于不受原料的限制、生产过程绿色清洁,因而具有很大的优势,其中,微生物代谢工程的发展为实现构建微生物高产细胞工厂提供了有力的支撑。紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)为三环二萜类生物碱,是目前唯一一种可以促进微管束聚合和稳定已聚合微管束阻断细胞正常分裂的药物,是治疗卵巢癌、乳腺癌等癌症的主流药物之一。紫杉醇主要来源于药用植物红豆杉树皮中,但红豆杉的生长周期特别长,且紫杉醇含量也特别低。因此,为解决严重的供需矛盾,亟需寻求紫杉醇新药源途径以满足临床上日益增长的需求。近来年,离子束生物工程技术作为一种全新的育种方法,因其独特的诱变和转基因机理,致使其已被广泛运用于农作物改良和微生物育种研究中。本论文首先对多形汉逊酵母DL-1(Hansenula polymorpha DL-1,H.polymorpha DL-1)的基因组DNA提取方法进行了优化;利用低能N+注入技术开展了低能离子注入介导H.polymorpha DL-1自身基因组DNA转化H.polymorpha DL-1细胞的研究,借助高渗筛选方法获得丙三醇高产酵母重组菌株,并明确了低能离子注入介导基因组转化H.polymorpha的最佳注入参数。进而,以最佳注入参数开展了低能N+注入介导异源药用植物红豆杉基因组DNA转化酵母的研究,结合紫杉醇化学性质,构建了能生物合成紫杉醇的酵母重组菌株。本研究为低能离子注入介导自身或异源基因组转化酵母提供了理论和实践依据,为开发药用植物有效成分新药源途径、保护野生药用植物资源提供了新途径、新方法,并为保障我国的甘油供给和保护我国红豆杉植物资源实现其可持续续发展提供了新思路。具体研究结果如下:(1)获得了低能离子注入多形汉逊酵母的存活率曲线图(即“马鞍型”曲线),明确了低能N+注入介导基因组DNA转化H.polymorpha DL-1的最佳离子注入参数为:能量:25ke V;剂量:25×101 5ion/cm2,真空度10-3Pa,脉冲时间:10s,间隔时间:10s。(2)获得了多形汉逊酵母基因组DNA的高效提取方法。结果表明Li OAC/SDS/玻璃珠组合法可以高效运用于提取H.polymorpha DL-1基因组。(3)确定了氯化钠的高渗筛选甘油高产菌株的方法。以此方法筛选出一株甘油高产酵母工程菌。通过摇瓶发酵培养后,甘油的产量和底物葡萄糖转化率分别为70.29g/L和53.37%,相对于出发菌株提高了27.25%。(4)建立了产紫杉醇酵母重组菌的高通量筛选方法。即PCR-液相组合筛选方法,具体为首先采用PCR技术对转化子进行高通量筛选,进而对候选转化子进行发酵,再采用TLC法以及RP-HPLC法对发酵液进行定性定量分析。其中,低能N+注入介导红豆杉基因组DNA转化H.polymorpha DL-1,存活率低,通过PCR方法进行初筛,呈阳性的菌株17株,占随机挑选菌落的1.7%;再利用TLC和RP-HPLC方法进行复筛,获得了一株产紫杉醇的重组菌株,编号为DL-781,保藏于CGMCC,编号No.8999。(5)产紫杉醇酵母重组菌株的发酵和遗传稳定性:将产紫杉醇酵母重组菌株在YPD液体培养基中摇瓶发酵培养72h后,紫杉醇产量为1.106mg/L,酵母生物量为3.98g/L;在无机培养基中摇瓶发酵培养72h后,紫杉醇产量为1.086mg/L,酵母生物量为2.46g/L。并将产紫杉醇酵母重组菌株继代培养8代,利用RP-HPLC法测定发酵液中紫杉醇含量,结果表明继代培养后,紫杉醇产量基本一致,表明该重组菌株遗传稳定。