马铃薯甲虫[Leptinotarsa decemlineata (Say)]是最具毁灭性的世界性马铃薯食叶害虫,也是我国重要的外来入侵物种之一。该虫自上世纪90年代初开始侵入我国新疆以来,持续向东传播,现分布扩展至北疆大部分区域。化学农药是控制马铃薯甲虫的主要手段。由于药剂的不合理使用,使得该虫对已使用的各类杀虫剂都产生了不同程度的抗性。持续监测和检测马铃薯甲虫的抗性动态,是制定合理抗性治理策略的必要前提。吡虫啉、噻虫嗪是目前防治新疆马铃薯甲虫的主要品种,有关其作用靶标烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)的研究较少,本文利用RNA干扰技术对其进行研究,可为探明马铃薯甲虫nAChR亚基的功能,抗性监测、治理及新药剂的开发也提供可靠依据。本文通过克隆马铃薯甲虫3个nAChRα亚基基因的cDNA全长序列,采用RNA干扰方法分析了几个nAChRα亚基基因被沉默后对马铃薯甲虫生长发育、存活率和药剂敏感性的影响,来明确这些基因的功能。现将研究结果总结如下：1.新疆北疆马铃薯甲虫对几种新烟碱类杀虫剂的敏感性测定为了掌握新疆马铃薯甲虫对新烟碱类药剂的抗性水平,2012年我们测定了新疆维吾尔自治区北疆的尼勒克、乌鲁木齐和阜康3个田间种群对啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和噻虫嗪的敏感性,并以常规的杀虫剂丁硫克百威、谷硫磷、高效氯氟氰菊酯(功夫)作为对照。结果表明乌鲁木齐田间种群成虫对噻虫嗪敏感性下降,阜康田间种群成虫对噻虫嗪产生了低水平抗性,马铃薯甲虫4龄幼虫阜康种群对吡虫啉处于敏感性降低阶段,同时还发现了马铃薯甲虫对三氟氯氰菊酯、丁硫克百威等常规药剂已产生高至极高水平的抗性。2.马铃薯甲虫3个烟碱型乙酰胆碱受体α亚基基因的克隆及表达分析通过克隆马铃薯甲虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)基因的全长序列并分析其时空表达量差异,为马铃薯甲虫nAChR亚基功能以及对新烟碱类药剂靶标抗性机制的研究提供重要基础。根据马铃薯甲虫转录组数据,验证并获得3条nAChR受体α亚基片段序列,通过Blast比对得出其分别属于nAChR α4、α7、α9亚基,进一步克隆得到这些α亚基基因的全长序列,分别命名为Ldα4、Ldα7和Lda9。克隆获得的这三个基因具备nAChRα基因的的典型结构特征,且与赤拟谷盗的相似性最高,分别为87、89和47%；表达谱分析表明,Ldα4、Ldα7、Ldα9、Ldα10亚基基因在马铃薯甲虫成虫中主要集中于头部和胸部,在蛹期、幼虫和成虫中均有表达,但表达量有明显差异,Ldα4、Ldα7分别在成虫、3龄幼虫的表达量最高,Lda9和Lda10基因蛹期阶段表达量最高。Ldα4、Ldα7、Ldα9和LdalO亚基基因在马铃薯甲虫不同生长阶段的表达量存在差异,推测这些亚基基因在马铃薯甲虫的不同生长发育中发挥特定作用。3.马铃薯甲虫nAChR RNA干扰体系的确立及对该虫生长发育和存活率的影响为了获得马铃薯甲虫nAChR基因有效的RNA干扰体系,本试验利用采自新疆乌鲁木齐马铃薯甲虫进行初步研究。分别用马铃薯叶片浸渍大肠杆菌表达的目标基因dsRNA菌液连续喂食马铃薯甲虫成虫和2龄幼虫7-10天,菌液浓度分别为稀释25倍、50倍、100倍,观察干扰后马铃薯甲虫的死亡率、化蛹率及羽化率情况,并利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。试验结果表明,与喂食dsGSP和水的幼虫相比较,在100倍浓度的dsRNA干扰9天后,幼虫体内Ldα7、Ldα10基因都显著下调。成虫喂食100倍dsRNA后,Lda10基因沉默效率最高,100倍的浓度干扰对于幼虫死亡率、体重和化蛹率及成虫死亡率都没有明显的影响。4.马铃薯甲虫nAChR RNA干扰的沉默效应及对药剂敏感性的影响基于马铃薯甲虫nAChR的RNA干扰体系的确定,为了明确新烟碱类杀虫剂与nAchR的相互关系,本试验分别用马铃薯叶片浸渍大肠杆菌表达的Ldα4、Ldα7、Ldα9、和Lda10的dsRNA菌液连续喂食马铃薯甲虫成虫和2龄幼虫7-10天,菌液浓100倍,观察比较试虫死亡率及试虫对噻虫嗪的敏感性,利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。结果表明,与对照相比,各个基因干扰后幼虫的基因表达量都有显著下调。相对表达量分别下降为：nAChRα4-1 74.62%, nAChRα4-2 80.17%, nAChRα7 78.64%, nAChRα9 77.30%, nAChRα10-1 90.18%, nAChRα10-241.89%。成虫干扰后,nAChRα4-1,和nAChRα4-2与GFP相比表达量下降,但差异不显著。其他基因显著性下调。目标基因沉默后,用噻虫嗪进行敏感性检测试验,发现与对照相比,nAChRα9基因干扰后经噻虫嗪处理幼虫的死亡率明显降低,其他基因干扰对噻虫嗪的敏感性没有明显影响。nAChRα10-2基因干扰成虫后的死亡率明显升高,对噻虫嗪的敏感性提高。