论文部分内容阅读
目的：研究小鼠脾淋巴细胞与B16肿瘤细胞培养上清相互作用不同时间后，淋巴细胞亚型活化程度；B16细胞培养上清的不同分子量组分对淋巴细胞趋化能力的异同，不同组分趋化的淋巴细胞的亚型组成及其各自的活化程度，不同组分激活的淋巴细胞肿瘤杀伤能力的差异。 方法：实验设计B16培养上清与淋巴细胞的相互作用分为两部分，第一部分：收集培养时间不同B16细胞培养上清与淋巴细胞共孵育不同时间，观察淋巴细胞亚型(CD4+T、CD8+T、B细胞)的活化程度。B16细胞常规传代培养，于对数期更换新鲜培养基分别于1h、6h、12h、24h收集B16的培养上清。用上述收集的B16培养上清重悬脾淋巴细胞，置于孔板内培养1h、6h、12h、24h，对照组为RPMI1640培养基，每时间点重复4孔。于各时间点收集淋巴细胞，用0.4％多聚甲醛固定，免疫荧光抗体标记淋巴细胞的亚型，观察淋巴细胞亚型的变化及活化比例。第二部分：B16培养上清分离纯化后对淋巴细胞的作用，用超滤离心管将B16培养上清分为以下7组趋化液：Ⅰ3-5KD；Ⅱ5-10KD；Ⅲ10-30KD；Ⅳ30-50KD；Ⅴ50-100KD；Ⅵ100-300KD；Ⅶ>300KD。利用Boyden小室观察趋化反应，趋化时间分为0.5h、2h、4h、8h、12h、24h，每组设4个复孔，RPMI1640作为空白对照，观察每段趋化液对淋巴细胞的趋化作用的强弱。收集趋化到下室的淋巴细胞，固定，免疫荧光抗体标记，观察淋巴细胞的亚型变化。将脾淋巴细胞与各组趋化液共孵育，一部分CCK-8试剂检测激活的淋巴细胞的细胞毒作用，另一部分淋巴细胞固定，免疫荧光抗体标记。 结果：1.荧光标记细胞亚型变化。同一时间点收集的培养上清，随着与淋巴细胞共孵育时间的延长，CD4+T、CD8+T、B细胞的比例没有变化，但是各型细胞活化的比例升高。在孵育相同时间下，不同组的上清活化的细胞比例也各不相同。其中培养24h收集的B16细胞上清与其他组相比，活化的各亚型细胞比例最高，而且与淋巴细胞共孵育24小时后各亚型活化的比例也是最高，但是该条件下淋巴细胞的存活率最低。 2.肿瘤培养上清分离纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳看到B16培养上清中的蛋白大部分集中在70KD左右，少量蛋白130KD-250KD之间，其他泳道没有看到明显的条带。 2.1随着趋化时间的延长，各段趋化液趋化淋巴细胞数目逐渐增多，在趋化24h时细胞数目达到平台期，30-50KD趋化淋巴细胞数目最多(89.25±1.71)×104/ml，50-100KD次之(69.75±0.96)×104/ml，再其次10-30KD(63.00±1.63)×104/ml和100-300KD(46.25±1.26)×104/ml，其他片段趋化的淋巴细胞数与对照组相比没有统计学差异。 2.2肿瘤培养上清分离纯化后，不同片段对三种细胞均有趋化作用，但是对淋巴细胞活化的亚型不相同。中分子量的蛋白活化的主要是CD4+T细胞和B细胞，而高分子量的蛋白对三种细胞均有活化，但活化的CD8+T细胞比例比其他组高。单独用各趋化液与淋巴细胞共孵育，结果同上。 2.3用CCK-8检测淋巴细胞毒性，结果显示所有片段活化的淋巴细胞均有杀伤肿瘤细胞的活性，130KD左右的蛋白活化的淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用最强。 结论：从上述实验中我们可以得出：1、B16细胞培养上清中含有肿瘤细胞所合成和分泌的物质，这些物质对淋巴细胞产生趋化和活化作用。培养上清趋化和活化的淋巴细胞的能力随B16培养时间的延长而增强。2：肿瘤培养上清中不同分子量片段对淋巴细胞的趋化及活化作用不同：中分子量片段的趋化能力较强，对B细胞及CD4+T细胞的活化能力较强，对CD8+T的活化能力很弱；高分子量片段的趋化能力较弱，但是对产生趋化反应的淋巴细胞各亚类都具有较强的活化能力，尤其是对CD8+T的活化能力。