随着人类基因组测序的完成,对人体及动物体内另一个庞大的“器官”——消化道微生物区系的研究也被日益重视。近年来有研究表明,某些消化道微生物,如拟杆菌、厚壁菌、产甲烷古菌等,可能与宿主能量代谢和脂肪沉积有关。本论文主要关注后肠产甲烷古菌与SD大鼠脂质代谢之间的相互关系。作者首先建立了两种不同脂质代谢类型猪(二花脸、长白猪)后肠产甲烷古菌的16S rRNA基因克隆库,结果表明,二者后肠产甲烷古菌结构区别较大,暗示体脂含量不同的个体后肠产甲烷古菌构成不同,消化道产甲烷古菌可能影响着宿主能量代谢和脂肪沉积。随后,以SD大鼠为模型动物,通过添加产甲烷古菌抑制剂BCM,观察了后肠产甲烷古菌被抑制前、后,及重新定植后,SD大鼠后肠产甲烷古菌构成与数量的变化,并比较了与脂质代谢相关的血清生化指标水平、日增重、附睾脂肪垫重、脂质代谢相关基因表达量、结肠内容物中代谢产物水平的变化。结果表明,与对照组大鼠相比,后肠产甲烷古菌被抑制后的SD大鼠体脂含量更高,各项指标显示其更倾向于肥胖。根据本研究结果总结了产甲烷古菌作用于宿主脂质代谢的可能途径。1二花脸与长白猪粪样产甲烷古菌16S rRNA克隆文库的建立与比较分别建立了二花脸(脂肪型)与长白猪(瘦肉型)粪样中产甲烷古菌的16S rRNA基因克隆文库。限制性酶切片段长度多态性(restrict fragment length polymorphism, RFLP)结果显示,二花脸猪381个克隆共分为14个操作分类单元(Operational Taxonomic Unit, OTUs);长白猪384个克隆共分为43个OTUs。测序结果显示,二花脸猪16S rRNA克隆库中占总克隆数46.2%的克隆与Methanobrevibacter sp.最相似(相似性≥97%)；29.1%与Methanobrevibacter smithii最相似；未鉴定的克隆数占24.7%(相似性<97%)。长白猪16S rRNA克隆库中占总克隆数34.9%的克隆与Methanobrevibacter smithii最相似；16.1%与Methanobrevibacter sp.最相似；7.6%与Methansphaera stadtmanae最相似；未鉴定的克隆数占41.4%。结果表明,长白猪粪样中产甲烷古菌16S rRNA基因多样性优于二花脸猪,且存在二花脸猪中未克隆到的Methansphaera stadtmanae。由于二花脸猪与长白猪属于不同的脂肪代谢类型,因此后肠中产甲烷古菌多态性的差异说明其可能与宿主脂质代谢之间存在一定关系,虽然不能排除遗传因素和环境影响。2肠道产甲烷古菌被抑制的SD大鼠模型的建立通过灌胃产甲烷菌抑制剂溴氯甲烷(Bromochloromethane, BCM)建立了消化道甲烷菌被抑制后的SD (Sprague Dawley, SD)大鼠模型,并通过体外发酵试验测试了BCM对消化道细菌多样性无影响。结果显示,灌胃BCM (0.3g/100kg体重浓度)10天后,经Real-time PCR检测,大鼠粪样中产甲烷古茵数量比对照组有明显下降；灌胃30天,粪样中产甲烷古菌数量比对照组下降了约10倍,且粪样中产甲烷古菌的数量在之后30天内不再继续下降。由此确定,灌胃该浓度的BCM30天后可最大限度抑制大鼠肠道产甲烷古菌数量,在体试验周期可确定为30天。体外发酵试验结果表明,与对照组相比,添加该浓度BCM可显著降低发酵物中甲烷产量。添加BCM 24h时,发酵样品中甲烷产量最低,从24h至72h甲烷产量有轻微回升,但未达到显著水平。DGGE结果表明,各时间点(Oh、4h、8h、12h、24h、48h、60h、72h)发酵样品中细菌菌群未发生明显改变,暗示该浓度BCM对细菌生长无不利影响。3灌胃BCM对SD大鼠粪样产甲烷古菌构成及数量的影响采用PCR-DGGE技术研究了灌胃BCM前后、停止灌胃、停止灌胃并接种正常大鼠粪样发酵物后,SD大鼠粪样中产甲烷古菌菌群及数量随时间的变化。DGGE结果显示,灌胃10天后,即有条带从粪样产甲烷古菌DGGE图谱上消失；灌胃30天后,大量条带消失。经测序鉴定,这些消失的条带大部分与Methanobrevibacter gottschalkii相似,仅有少数条带与Methanobrevibacter smithii和Methanobrevibacter sp.相似。Real-time PCR结果显示,灌胃30天后,粪样中产甲烷古菌数量比对照组明显降低；与继续灌胃组相比,在停止灌胃或停止灌胃并接种正常大鼠粪样发酵物后,DGGE图谱上陆续出现大量条带。经测序鉴定,这些条带与之前消失的条带吻合,且Real-timePCR结果显示粪样中产甲烷古菌数量明显比继续灌胃组更多。以上结果说明灌胃BCM后,SD大鼠肠道中产甲烷古菌被大量抑制,且被抑制的古菌大多属于Methanobrevibacter gottschalkii。4抑制消化道产甲烷古菌对SD大鼠肥胖相关血清生化指标、日增重、附睾脂肪垫重的影响通过对SD大鼠灌胃BCM观察了消化道产甲烷古菌被抑制前后,与肥胖相关的大鼠血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、葡萄糖、胆固醇、甘油三酯等生化指标,及日增重和附睾脂肪垫重量的变化。结果显示,灌胃BCM30天后,大鼠血清LDL、胆固醇,以及附睾脂肪垫重量和日增重均显著高于对照组(P<0.01)；而停止灌胃或停止灌胃并接种正常大鼠粪便发酵物后,大鼠血清HDL、LDL、胆固醇,以及附睾脂肪垫重量和日增重均显著低于继续灌胃组(P<0.05),但停止灌胃组与接种组之间这些指标无显著差异(P>0.05)。以上结果说明抑制消化道产甲烷古菌后,大鼠体脂含量明显增加,血清指标显示其倾向于肥胖；在肠道产甲烷古菌群恢复后,这些指标有所改善。5抑制消化道产甲烷古菌对SD大鼠脂质代谢相关基因表达量的影响通过Real-time PCR相对定量方法观察了SD大鼠后肠产甲烷古菌被抑制前、后以及重新定植后,大鼠附睾脂肪垫、肝、结肠中脂质代谢相关基因表达量的变化。这些基因包括过氧化物酶体增殖物激活型受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、禁食诱导脂肪因子(fasting-induced adipose factor, Fiaf)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)、瘦素(Leptin)、蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A, PP2A)、固醇调节元件结合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1 c, SREBP-1c)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element-binding protein, ChREBP)、脂联素(adiponectin, Adi)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)。结果表明,与对照组相比,灌胃BCM30天后,大鼠附睾脂肪垫、肝、结肠中PPARγ、 Fiaf、LPL、PP2A、SREBP、ChREBP、FASN以及附睾脂肪垫中Adi基因相对表达量均有显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),但瘦素表达量无明显变化(P>0.05)；而与第二阶段继续灌胃BCM的大鼠相比,停止灌胃或停止灌胃并接种正常大鼠粪样发酵物后,大鼠附睾脂肪垫、肝、结肠中PPARγ、Fiaf、LPL、SREBP、 ChREBP、 FASN均显著下调(P<0.05),附睾脂肪垫中Adi基因表达量显著上调(P<0.05), PP2A基因表达量仅在肝脏中被显著上调(P<0.05),仅在接种组大鼠附睾脂肪垫中发现瘦素表达量显著上调(P<0.05),停止灌胃和接种组大鼠肝、结肠中均发现瘦素表达量的显著上调(P<0.05)。在肝和结肠中未检测到Adi基因表达。以上结果说明,当大鼠后肠产甲烷古菌被抑制后,大鼠3个组织中,几乎所有与脂质代谢相关的基因表达均被检测到显著上调,而随着产甲烷古菌在后肠的重新定植,这些基因表达量又呈现相反变化,结合这些基因之间的相互关系,以上结果暗示了后肠产甲烷古菌被抑制的大鼠能吸收更多脂质,从而促进机体脂肪沉积。6抑制消化道产甲烷古菌对SD大鼠结肠内容物中代谢产物的影响利用核磁共振(1H-NMR)方法分析了灌胃BCM前、后,以及停止灌胃(St)、停止灌胃并接种健康大鼠粪样发酵物(In)后,大鼠结肠内容物中代谢物的变化。PCA得分图谱结果显示,所有组别均可以完全区分。荷载图结果显示,灌胃BCM前、后,大量代谢产物水平产生变化。与对照组相比,处理组大鼠结肠内容物中乳酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙酸、乙酸及一些未知糖类和氨基酸水平均有降低,而丁酸、琥珀酸水平则有所升高；在第二实验阶段,与继续灌胃组相比,St和In组大鼠结肠内容物中缬氨酸水平有所降低,而丙酸、丁酸、异亮氨酸、乙酸及未知糖类和氨基酸水平则有所升高。以上结果暗示当后肠产甲烷古菌活性被抑制后,大鼠结肠内容物中挥发性脂肪酸、氨基酸、糖类等代谢物发生变化,并通过相互作用影响大鼠能量和脂质代谢。