需冷量是否满足影响着果树作物的花芽质量和水果产量,而休眠是一种积累需冷量的过程。梅是一种蔷薇科植物,起源于中国,具有很好的观赏价值及食用价值。由于其早春开花而且有较小的基因组测序数据,被认为是研究休眠良好的材料。近几年,microRNA被报道在植物生命过程的各个阶段都起着重要的作用,为了研究microRNA在梅休眠中的调控作用,进一步了解休眠的分子机理。本文以梅品种‘桃型梅’的不同休眠阶段的花芽为材料进行了 miRNA高通量测序并进行分析。深入研究了在休眠进程中表达量变化明显的miR169家族,并通过RLM-5’RACE实验验证其预测靶标。GA4处理梅休眠枝条检测NF-Y家族三个亚族基因PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1的表达趋势。进一步通过酵母双杂交实验以及双分子荧光互补实验证明PmRGL2、PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1蛋白两两之间的互作关系。主要结果如下:1.通过对休眠四个时期梅花芽材料进行miRNA组测序,从2709万clean reads中得到了共679个新型miRNA和199个已知miRNA可能参与梅休眠。差异表达的已知miRNA属于55个保守的miRNA家族,其中miR159家族最多,其次是miR166,miR156和miR171家族,这些家族被报道在休眠或者开花中起重要作用。对差异表达的miRNA进行靶基因预测,预测靶向基因中有很多转录因子或与激素合成和信号传导相关。我们随机挑选了 9个miRNA进行qRT-PCR验证,与转录组测序结果的表达趋势基本一致。2.miRNA测序结果中,miR169家族由于其在诱导休眠阶段表达量上升,而在休眠解除阶段表达量明显下降的特点引起了我们的注意,并且其预测靶向转录因子NF-YA。通过结合休眠不同时期的转录组结果数据初步说明两者可能存在靶向关系,NF-YA在诱导休眠阶段表达水平下降,在休眠解除阶段上升,与miR169呈现相反的表达趋势。最后通过RLM-5’RACE实验证实了 miR169e3靶向PmNF-YA3,并且在miR169成熟体5’端第9和第10位点处切割。3.为检测NF-Y家族在赤霉素诱导梅休眠解除中的作用。以高需冷量品种‘丰后’休眠时期一年生枝条为材料采用外源GA4处理,采集处理后0d、3d、5d、8d、10d的枝条花芽,提取RNA进行用qRT-PCR实验验证NF-Y家族基因的表达量变化。结果显示,GA4处理后NF-YA家族基因PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1表达量明显上升,与GA信号抑制因子PmRGL2表达趋势相反。4.验证NF-Y家族与PmRGL2的关系。构建了PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1基因的酵母双杂交猎物载体和诱饵载体。将猎物质粒AD转入Y187,诱饵质粒转入Y2H Gold并进行重组质粒的毒性检测和自激活检测。结果表明,它们对酵母菌株没有毒性且自身没有转录激活活性。将猎物质粒和诱饵质粒共同转入Y2H Gold酵母感受态进行酵母双杂交实验。结果显示PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1蛋白之间相互作用,并且都与PmRGL2蛋白存在互作。利用双分子荧光互补实验对蛋白互作进行验证,与酵母双杂结果一致。