前言 细胞外基质(ECM)由细胞间的多种蛋白质和非蛋白质组成，构成细胞生活的微环境，具有支持、连接、营养和防御等生理作用。基底膜主要由ECM构成。基质金属蛋白酶(MMP)是分解细胞外基质(ECM)的蛋白酶类中最重要一类，在基底膜降解中起着主要作用。本研究目的是研究短暂大脑中动脉阻塞(MCAO)诱导局灶脑缺血后，MMP-2、MMP-3及MMP-9在不同时间的表达及细胞分布情况。进一步评估MMP-2、MMP-3及MMP-9与缺血脑组织损伤的关系。 材料和方法 一、动物来源及分组 健康雄性Wistar大鼠40只，体重250-280g。 随机分组(1)对照组1正常对照组n=5；2假手术组n=5；(2)实验组1—6组，动物缺血120分钟再灌注6小时为1组；再灌注12小时为2组；再灌注24小时为3组；再灌注3天为4组；再灌注5天为5组，再灌注7天为6组；每组n=5。 二、大鼠短暂脑缺血动物模型建立 腹腔注射10％水合氯醛按35mg／100g的制剂注射麻醉。置大鼠仰卧位固定于手术台上，颈正中切开，手术显微镜下分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，热凝并切断ECA两分支枕动脉，甲状腺上动脉，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA分离ICA的颈外分支翼腭动脉(PPA)，穿线沿其起点结扎，ECA近端备线，用动脉夹暂时阻断CCA及ICA，轻轻向下牵拉ECA残端在ECA剪一小口，将制备好的直径0.2mm，头端0.5mm的尼龙线1插入ECA，扎紧备线，放开动脉夹，轻轻推进尼龙线，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA)，断右侧大脑中动脉(MCA)所有血液来源，尼龙线插入深度距分叉为18.5±0.5mm，缝合皮肤，外留Icm长尼龙线头，缺血时间为120分钟，再灌注时轻轻提拉所留线头，至到有阻力时提示尼龙线尖端已至颈外动脉残端。如动物已清醒，需再次麻醉后再灌注。假手术除不插尼龙线外其余步骤同上。 三、免疫组化染色:取相邻切片分别进行MMP一兔多抗MMP召及MMP一染色。具体步骤: 1.用二甲苯及乙醇处理标本脱石腊 2.3%过氧化氢孵育5分钟，消除内源性过氧化物酶活性。 3.蒸馏水冲洗，0.olMPBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 4.封闭用10%正常羊血清工作液室温孵育10分钟。 5.滴加兔抗鼠MMP一IgG及MMp一IgG、MMp一IgG一抗工作液(1:50稀释)室温孵育过夜。 6.0.01MPBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 7.滴加生物素标记的第二抗体，37℃孵育30分钟。 8.0.01MPBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 9.滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃孵育30分钟。 10.0.olMPBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 11.滴加新鲜配制DAB液，观察显色情况。 12.自来水冲洗中止反应。 13.苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中止树胶封片。 14.正常对照:以0.olMPBS置换一抗。 四、统计学方法 观察结果以.又士s形式表示，统计处理用方差分析及t检验。实验结果 1.在正常对照组中发现MMPZ、MMP一及MMP一免疫阳性细胞。 2.在缺血对侧没有MMP一、MMP一及MMP一表达。 3.MMP一在星形细胞、巨噬细胞中表达。免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染。MMP一阳性表达细胞数与对照组在缺血再灌注3天、5天、7天增加显著，其中5天为高峰期。见表1。 4.MMP一在内皮细胞、小胶质细胞中出现。免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染。MMP一阳性表达细胞数与对照组在缺血再灌注12小时、1天、3天、5天、7天均增加，其中1天为高峰，3天、5天、7天渐下降。见表2。 5.MMP一在小胶质细胞、缺血神经元、内皮细胞、嗜中粒细胞中表达。免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染。MMP一阳性表达细胞数与对照组在缺血再灌6小时无明显差别。在缺血再灌注1天、3天、5天、7天均显著增加，其中3天为高峰期，5天、7天渐下降。见表3。讨论 本研究提示在MCAO/R后的不同时相，在星形细胞、巨噬细胞中有MMP一表达;在小胶质细胞、内皮细胞、嗜中粒细胞、缺血神经元有MMP-9及MMP一表达。免疫组化显示，在正常人cNs中，脑血管内皮细胞[e1、星形细胞〔’〕和小胶细胞[‘刀中己经发现MMP一、MMP一和MMP一。这可以解释正常对照组有少量的MMP一、MMP一及MMP一的表达。 本研究发现MMP一、MMP一及MMP一的表达有时间依赖性，MMP一在MCAO/R后出现较晚于第5天达高峰，而MMP一和MMP一出现较早，分别在MCAO/R后1天、3天出现高峰。这种时间依赖与MMP一及MMP一、MMP一在MCAO/R中的作用密切相关。Rosenberg等[s1用免疫组化对再灌注鼠脑产生的MMPS进行细胞定位，通过细胞培养研究其激活形式，发现自发性高血压大鼠(5 HR)予大脑中动脉闭塞90分钟，随后再灌注3小时至21天，假手术对照组大鼠显示MMP一在血管附近的星形胶质细胞突起表达，再灌注3小时后MMP一在星形胶质细胞开始增加，24小时有MMP一3与MMP一表达，其中MMP一3由小胶质细胞和缺血神经元激活表达，MMP一于48小时在内皮细胞，中性粒细胞和神经元表达。于第5一21天MMP一在缺血中心周围反应性胶质细胞表达。通过脂多糖刺激星形胶质细胞和小胶质细胞培养研究MMP的激