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目的：Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type Ⅱ Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶，在哺乳动物的许多生物学过程中扮演着重要角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。在人类，TTSPs共有17个成员，其中研究比较广泛的matriptase在正常生理、病理及肿瘤中起着广泛而重要的作用，但是它在恶性血液疾病如慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL）中的生物学功能目前尚无相关报道。本研究旨在探讨Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶在恶性血液疾病细胞中的表达。基于前期研究结果，我们以matriptase作为重点研究对象，深入探讨matriptase在CLL中的作用及机制，为进一步研究Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶的功能以及它们在恶性血液疾病发生发展中的作用提供依据。方法：（1）利用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription PCR，RT-PCR）技术对人恶性血液病细胞系和恶性血液病患者骨髓细胞中17种TTSPs mRNA的表达进行分析；（2）实时定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测白血病患者骨髓细胞中matriptase及其内源性特异性抑制剂肝细胞生长因子激活物抑制剂1（Hepatocyte growth factor activator inhibitor-1，HAI-1）mRNA的表达；（3）Western blot检测恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中matriptase蛋白的表达；（4）流式细胞术和免疫荧光染色检测Namalwa细胞系和CLL患者骨髓细胞中matriptase蛋白的表达及定位，以正常人外周血（Normal peripheral blood，NPB）白细胞作对照；（5）利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒，并转导B细胞来源的淋巴瘤细胞系Namalwa用于干扰matriptase mRNA的表达，qRT-PCR和Western blot技术检测干扰效率；（6）基底膜侵袭实验（Transwell InvasionAssay）检测matriptase表达下调后及matriptase特异性抑制剂HAI-1作用后肿瘤细胞侵袭能力的改变；（7）细胞迁移实验（Transwell MigrationAssay）检测HAI-1作用后肿瘤细胞迁移能力的改变；（8）细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8, CCK-8）检测HAI-1作用后肿瘤细胞增殖能力的影响。结果：（1）采用RT-PCR技术对15种人恶性血液病细胞系和81例恶性血液病患者骨髓细胞中17种TTSPs mRNA的表达进行分析，发现matriptase、HATL4、polyserase-1等TTSPs mRNA在某些恶性血液病细胞系或白血病患者骨髓细胞中特异性高表达，如matriptase mRNA在B细胞来源的淋巴瘤细胞系（Namalwa和Raji）和CLL患者骨髓细胞中表达特异性增高，而在其它恶性血液病细胞系或白血病骨髓患者细胞中基本检测不到表达；HATL4mRNA在急性髓系白血病（AcuteMyelocytic Leukemia，AML）患者骨髓细胞中表达特异性增高，而在其它白血病患者骨髓细胞中基本检测不到表达。我们以在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中高表达的matriptase作为重点研究对象，进一步探讨其在CLL病程进展中的生物学功能及作用机制。（2）qRT-PCR技术定量地检测了49例白血病患者骨髓细胞中matriptase和HAI-1mRNA的表达。结果显示matriptase mRNA在CLL患者骨髓细胞中高水平表达，表达量为正常人外周血（Normal Peripheral Blood，NPB）和正常人骨髓（Normal bone Marrow，NBM）细胞表达量的22倍以上，在其它类型白血病患者如AML、急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphocytic Leukemia，ALL）、慢性粒细胞性白血病（Chronic Myelocytic Leukemia，CML）中几乎检测不到；而HAI-1mRNA在CLL中的表达量很低。（3）利用Western blot检测人恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中matriptase蛋白的表达。结果显示matriptase在B细胞来源的淋巴瘤细胞系（Namalwa和Raji）和CLL患者骨髓细胞中表达明显增加，而在其它细胞系或白血病患者骨髓细胞中检测不到，与mRNA的表达结果一致。（4）流式细胞术结果表明matriptase在Namalwa细胞和CLL患者骨髓细胞中的阳性表达率分别为99%和93%，而在NPB细胞表面的表达为阴性（0.5%）。免疫荧光染色发现，matriptase定位于Namalwa和CLL患者骨髓细胞的膜表面，且表达量明显高于NPB。（5）将含siM（包含特异性沉默matriptase的shRNA核苷酸序列）和siC（包含一段无义的对照shRNA核苷酸序列）穿梭质粒的病毒转导Namalwa细胞，siM和siC病毒载体上含有绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。培养72h后，流式分选得到GFP阳性率大于99%的细胞。通过qRT-PCR和Western blot技术检测发现，与对照组siC相比，在转导siM病毒的Namalwa细胞中，matriptasemRNA和蛋白表达抑制率>80%。这一结果表明，我们采用shRNA沉默matriptase表达的实验是成功的，可用于后续相关的功能学研究。（6）基底膜侵袭实验表明，Namalwa细胞的matriptase mRNA表达下调后，穿过基底膜Matrigel胶的细胞数量明显减少；通过HAI-1抑制matriptase蛋白活性后，Namalwa和Raji细胞降解基底膜Matrigel胶的能力均显著降低；HAI-1作用于CLL患者骨髓细胞后，与加入缓冲液对照（Buffer Ctrl）组相比，CLL细胞降解基底膜Matrigel胶的能力显著降低，而加入胰蛋白酶抑制剂（Soybean TrypsinInhibitor，STI）组则没有差异。这提示matriptase可能通过降解细胞外基底膜来增强细胞的侵袭性，参与CLL的发生发展过程，这一作用能被HAI-1所抑制。（7）肿瘤细胞迁移实验表明，加入不同浓度HAI-1后，Namalwa、Raji以及CLL患者骨髓细胞的迁移能力没有明显改变。（8）肿瘤细胞增殖实验表明，加入不同浓度HAI-1后，Namalwa、Raji以及CLL患者骨髓细胞的增殖能力没有明显改变。结论：我们在国内外最先研究发现matriptase在CLL患者骨髓细胞中特异性高表达，提示matriptase可能成为CLL新的细胞膜生物标记。下调白血病细胞中matriptase的表达及用其特异性抑制剂HAI-1抑制matriptase活性后，肿瘤细胞在transwell invasion实验中的侵袭能力显著下降，提示通过特异性抑制剂或外源性药物抑制matriptase活性，可以成为CLL治疗的新靶点，以抑制CLL细胞在组织中的浸润及扩散能力。